间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是存在于骨髓基质中的一种多能干细胞，它包含不同的克隆亚群，这些克隆亚群之间在细胞形态、增殖能力和细胞功能上存在差异。单细胞克隆（Single Cell Cloning，SSC）是由单个细胞不断分裂扩增而形成一个更纯的细胞群。建立MSCs的单细胞克隆，即形成MSCs的不同细胞亚群，非常适合于研究MSCs不同细胞亚群的生物特性和分化能力等方面的差异，是研究这些不同克隆亚群之间差异的很好的模型。　　 目前，MSCs移植用于治疗疾病的报道已经很多，但是MSCs疗法普遍的问题是注射后能够存留的细胞数量有限，细胞成活率却较低。而这数量仅存的细胞只有极少量的分化为神经细胞，这是治疗效率低的一大瓶颈问题。在未来的研究和临床治疗应用中，我们渴望找到分化能力最强的克隆，这样理想的克隆可以用来做优良的种子细胞，将来利用克隆亚群针对性治疗疾病对于治疗效果的提高具有极其重要意义。　　 然而，如何区分并筛选出分化能力不同的MSCs克隆亚群？如果有这样的区分亚群的标记物，那么问题就迎刃而解了。但是，在目前的研究水平，要精确的区分MSCs分化能力不同的亚群还不太可能，目前还没有找到区分不同克隆亚群的标志物。　　 我们选择miRNA-9、Nestin和neuroD1作为研究指标，来研究MSCs不同克隆之间神经方向分化潜能是否存在差异，以及miRNA-9对MSCs神经分化潜能的影响。并探讨是否可以用miRNA-9来作为神经方向分化能力差异的标记物，为今后的研究做铺垫。　　 实验方法：　　 一、MSCs的培养和单克隆制备　　 培养全骨髓细胞，随着换液和MSCs的增殖，可以得到纯度95％以上的MSCs。原代MSCs传代时，制备1/100μl细胞密度的细胞悬液，种植在96孔板中，每个孔加100μl细胞悬液，也就是每个孔有一个细胞，这一个细胞长成细胞集落，即是单克隆细胞群。　　 二、不同单克隆miRNA-9、nestin和NeuroD1的表达差异　　 收集不同的克隆亚群，所收集的所有克隆miRNA-9的表达量的均值作为1，各个克隆miRNA-9的相对表达量与均值相比较得出。nestin和neuroD1的相对表达两的计算也同样。按照miRNA-9的相对表达量的差异，把收集的克隆分成三组。用Real-time PCR的方法检测不同克隆miRNA-9、nestin和neuroD1的差异。并进行相关性分析。　　 三、转染miRNA-9前体，检测转染前后miRNA-9、nestin和neuroD1的变化情况　　 MSCs转染miRNA-9前体，转染时间分为0h，24h，48h，96h。分析转染前后和不同转染时间miRNA-9、nestin和neuroD1的变化，研究miRNA-9对MSCs神经方向分化的作用。　　 实验结果　　 一、MSCs的培养和单克隆的制备　　 原代培养24h后，小部分细胞贴壁，细胞梭形不明显。48h后可见细胞集落。单细胞克隆第3天时可见几十个细胞的小集落。第5-7天集落铺满。不同的克隆生长速度和细胞形态之间有差异。　　 二、不同单克隆miRNA-9、nestin和neuroD1的表达差异　　 不同克隆miRNA-9、nestin和neuroD1的表达存在差异。Nestin是神经前体细胞的标记物，neuroD1是神经元的标记物，二者的总和记为nestin+neuroD1，可以作为MSCs向神经方向分化的标记。相关性分析发现，miRNA-9与nestin和neuroD1的总和正相关。　　 三、转染miRNA-9前体，检测转染前后miRNA-9、nestin和neuroD1的变化情况　　 转染后各时间段miRNA-9含量均比未转染的MSCs miRNA-9含量增高。其中转染24h miRNA-9含量最高，以后逐渐下降。转染后各时间段nestin和neuroD1的表达量升高，其中72h表达量最高。说明miRNA-9能够促进MSCs向神经方向分化。　　 结论：　　 1、MSCs存在神经方向分化潜能不同的克隆亚群。　　 2、转染miRNA-9会促进MSCs向神经方向分化。