十三碳二元酸在发酵过程中跨细胞质膜运输及调控

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长链α,ω-二元酸是一种重要的精细化工原料,广泛用于香料、热熔胶、工程塑料和高级润滑油等化工产品的生产。热带假丝酵母(Candidatropicalis)突变株能氧化从C10到C18的正构烷烃或脂肪酸生产相应碳数的长链二元酸。本文以热带假丝酵母突变株CGMCC356生产十三碳二元酸的过程为研究对象,研究了十三碳二元酸跨细胞质膜运输机理,并以此为理论基础提出了提高产酸水平的有效方法。 首先,确立了热带假丝酵母细胞内pHi的分析方法。采用荧光探针技术通过双醋酸羧基荧光素首次测量了热带假丝酵母细胞在发酵过程中的生理pHi,产酸期pHi在6.2-6.7之间,pHi对P450酶诱导合成有调控作用。产酸期间细胞内外两侧只有未解离的二元酸浓度保持顺化学浓度梯度。 其次,采用不同类型抑制剂研究了十三碳二元酸跨细胞质膜运输机制。用离子载体缬氨霉素、尼日利亚菌素和羰基-氰-m-氯苯基腙以及两性霉素B实验,证明了十三碳二元酸分泌是电中性运输,且与质子电化学梯度无关;用磷酸结构类似物钒酸钠和解偶联剂2,4-硝基苯酚实验,表明了运输过程与ATP无明显依赖关系。N-乙基马来酰亚胺和二环己基碳二亚胺能特异地抑制十三碳二元酸分泌,导致细胞内二元酸的积累,表明了有载体参与运输,这种运输过程还存在底物特异性,从而证明了十三碳二元酸分泌是促进扩散过程。 最后,依据促进扩散理论,细胞质膜外侧的十三碳二元酸的解离过程是控制菌体产酸的一个限速步骤。通过实验建立了最高产物浓度与pH之间的关联式;提出pH梯度控制策略,并建立了pH梯度控制模型,用于发酵产酸量达到153g/L,较最佳恒定pH8.0发酵提高了22.4%;应用于20m3发酵罐试验,产酸量在140g/L以上,最高产酸达到162g/L,证明本文提出的pH梯度控制模型是可靠的,具有实用价值。
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