肿瘤标志物以无创性和简便的优点成为肿瘤早期诊断和病情监测的重要指标。表观遗传学兴起为从该角度推动肿瘤分子标志物发展提供了可能。DNA甲基化是表观遗传学三个组成部分之一，也是迄今为止研究最为成熟的一部分。DNA甲基化在肿瘤细胞中的具体表现为肿瘤细胞基因组整体的甲基化水平降低和特定基因5端区域异常的甲基化改变两类。以特定基因5端CpG位点甲基化模式改变来早期诊断和描述肿瘤已有较多报道。 本课题首先把这一领域的先进理论和方法学进展引进到研究具有我国地域特色的恶性肿瘤——原发性肝细胞癌(HCC)的研究中，试图通过分析大多数肿瘤细胞表达而正常细胞不表达的肿瘤－精细胞系(CT)抗原家族的黑色素瘤抗原(MAGE)基因家族，把MAGE-A基因家族5端CpG位点甲基化模式的改变作为HCC的新肿瘤标志物。在试验中，用亚硫酸氢盐修饰测序PCP(BSP)方法，直接把PCR产物测序，检查HepG2、BEL7402、BEL7404和BEL7407四种HCC细胞株和外周血白细胞(WBC)正常对照的甲基化模式的差异，寻找HCC特异的MAGE-A甲基化模式。根据HCC特异甲基化模式设计甲基化特异PCR(MSP)检测引物，建立区分HCC和正常对照的MSP，检测HCC和各种对照的病理切片和外周血浆游离DNA。 通过对肝癌细胞株的研究表明，在七个MAGE-A亚型中，MAGE-A1和MAGE-A3的5端CpG位点甲基化模式表现出与正常对照明显不同，由此设计的MSP检测HCC病人和非HCC对照中，石蜡包埋病理切片标本和外周血浆DNA，检测HCC的灵敏度分别是91.2％和61.5％，而特异度均可达到100％。为使用DNA甲基化肿瘤标志物诊断HCC提供了直接的证据。 HCC中MAGE基因的异常甲基化研究，既直接证明了发展DNA甲基化肿瘤标志物的可能性，也建立了本实验室研究DNA甲基化的方法学平台。不过，随着研究的深入，DNA甲基化肿瘤标志物研究中存在的一些问题也表现出来，突出体现在各文献报道中，同样的基因相似甲基化位点，在同样类型肿瘤标本中，甲基化检测的阳性率不一致，差别很大。这一问题不能得到澄清，必将成为发展DNA甲基化肿瘤标志物的主要障碍。我们推测关键原因有两点：(一)缺少对CpG位点全面甲基化状态分析，以局部代表总体，导致检测结果不一致；(二)缺乏大样本验证。对这两个问题的求证使本研究的方向转向了对血液系统恶性肿瘤这一亚型众多的肿瘤的研究，构成了本研究的第二章节的内容。 本课题对正常对照WBC细胞和HL-60、K562、Jurkat及U937等四种不同类型的血液系统疾病细胞株，用BSP方法，全长克隆测序P15、P73、O6MGMT、DAP-K、HIC1和CDH1等六个常见血液系统恶性肿瘤抑癌基因CpG岛区域。根据各BSP产物的多个克隆测序结果，绘制各型细胞基因组六个基因详细的甲基化状态频率图谱。分析该图谱，可见CpG位点区分为完全甲基化、完全去甲基化和部分甲基化三部分。显示了各细胞基因组特定甲基化模式，找到一系列各型血液系统恶性肿瘤细胞株特异性甲基化改变位点。选择出了可以作为区分这五种类型细胞的特异性DNA甲基化位点组合，也即这五种不同基因组代表的正常和四种类型血液病的，潜在的特异性DNA甲基化CpG位点库，作为进一步筛选DNA甲基化肿瘤标志物基础。该部分的初步完成，显示了特定基因DNA甲基化特异性改变诊断多种复杂肿瘤类型的能力，也显示了各种肿瘤中各基因甲基化状态的复杂性，提示了筛选DNA甲基化肿瘤标志物是一个需要反复筛查和验证的大工程。同时，为下一步通过大量临床标本验证DNA甲基化模式作为肿瘤标志物的效能提供大量的候选CpG位点。此外，对多株血液病细胞的多种抑癌基因甲基化模式的详细描述将为研究甲基化的表达调控机制及肿瘤逆转机制提供基本素材。