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在大肠杆菌(Escherichia coli)脂肪酸合成酶体系中fabA基因编码有功能的3-羟基脂酰ACP脱水异构酶,这是一个双功能的酶,此外还存在一个只具有脱水功能的酶蛋白FabZ。由于FabA在E.coli不饱和脂肪酸合成中负责关键的一步异构反应,因此被认为是不饱和脂肪酸合成中必不可少的关键蛋白。而fabB基因编码3-酮基脂酰ACP合成酶Ⅰ,该酶在不饱和脂肪酸合成途径中起着延伸FabA异构后的产物的功能。FabA-FabB途径被认为是变形细菌门(Proteobacteria)的α和γ类群在厌氧条件下合成不饱和脂肪酸的主要途径。
苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)Rm1021是已经被广泛认识的根瘤菌,能与二倍体和四倍体的苜蓿植物建立共生关系。基于苜蓿中华根瘤菌与豆科植物苜蓿之间的共生作用在农业上的重要性,苜蓿中华根瘤菌菌株Rm1021被选为研究共生固氮作用的模式菌株。
但是迄今为止,尚未见有对苜蓿中华根瘤菌fabA和fabB基因的研究报道,本课题组在进行充分的生物信息学分析之后发现SmFabA与EcFabA相似性达到60.6％,SmFabB与EcFabB相似性达到61.1%。并且通过蛋白序列比对,发现SmFabA与EcFabA具有相同的保守活性位点,SmFabB与EcFabB具有相同的Cys-His-His活性中心。
在此基础下,本研究围绕苜蓿中华根瘤菌不饱和脂肪酸的代谢,分别从体内互补、细胞膜磷脂组成分析、体外酶活性检测几个方面进行初步探索,研究苜蓿中华根瘤菌fabA和fabB两个基因编码的蛋白在不饱和脂肪酸合成中的功能及其赋予菌株的特性。
本研究首先将两个目的基因SmfabA和SmfabB分别克隆并构建了pBAD24M体内互补载体pJJ3和pJJ4。将pJJ3质粒载体转化大肠杆菌fabA温度敏感突变株CY57,进行遗传互补和放射性薄层层析分析,结果显示苜蓿中华根瘤菌的fabA基因能够互补大肠杆菌fabA温敏突变株CY57,而且在CY57/pJJ3突变株中检测到棕榈油酸(△9C16:1)和十八碳烯酸(△11C18:1)生成,因此可以初步判定SmFabA具有3-羟基脂酰ACP脱水异构酶活性。将pJJ4质粒载体分别转化大肠杆菌fabB温度敏感突变株CY242,大肠杆菌fabB温度敏感和fabF双突变株CY244,进行遗传互补和放射性薄层层析分析,结果显示苜蓿中华根瘤菌的fabB基因可以互补大肠杆菌fabB温敏突变株CY242,而且在CY242/pJJ4突变株中检测到棕榈油酸和十八碳烯酸生成,在CY244/pJJ4突变株中只检测到棕榈油酸生成,因此可以初步判定SmFabB具有3-酮基脂酰ACP合成酶Ⅰ活性。
为了进一步研究苜蓿中华根瘤菌fabA和fabB基因的功能,本研究首先构建了SmfabA和SrafabB两个基因的pET2gb蛋白表达载体pJJ5和pJJ6,随后分别转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,表达并分离纯化了SmFabA和SmFabB两种酶蛋白。其次利用体外脂肪酸合成反应体系,检测两个蛋白的酶活性。结果表明SmFabA能在体外条件下催化羟脂酰ACP的脱水,而且还能够催化反-2-癸烯脂酰ACP异构化。SmFabB能在体外条件下催化辛酰-ACP到反-2-癸烯酰ACP的延伸,还能够催化月桂酰ACP到豆蔻酰ACP的延伸。这些结果再次证明苜蓿中华根瘤菌FabA蛋白是一种双功能酶,即具有脱水异构酶活性,FabB蛋白具有3-酮基脂酰ACP合成酶Ⅰ活性。