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蔗糖转运蛋白是一类介导细胞跨膜转运蔗糖的膜蛋白,广泛存在于生物体内。糖在生物体内的生产、运输、消耗和储藏是一个由多种信号网络严格控制的过程,这个过程的调节服从于细胞的发育和对环境适应的需求,而糖运载蛋白是这个复杂网络中的一个重要组分或者调节者。到目前为止,人们对植物糖运载蛋白功能调节的细胞信号过程知之甚少。本文在克隆拟南芥蔗糖转运蛋白基因AtSUC4的基础上,应用酵母双杂交和双分子荧光互作技术研究了拟南芥蔗糖转运蛋白AtSUC4的蛋白-蛋白互作信号,结果如下:
利用Clontech公司的SMART技术建立了拟南芥叶片的全长cDNA文库。在第一链合成中,CD III/3’PCRPrimer作为3’引物,而SMARTⅣOligo作为mRNA5’的暂时模板,因此合成的单链cDNA5’末端有一段补足的SMARTⅣOligo序列,在利用长片段PCR反应合成双链cDNA时,此序列将成为引物结合位点。
利用Split Ubiquitin System筛选拟南芥蔗糖转运蛋白AtSUC4的互作因子。在筛选过程中,首先以拟南芥蔗糖转运蛋白AtSUC4为“诱饵”连接到Split Ubiquitin System系统中的“诱饵”载体pTMBV4上,拟南芥cDNA文库则连接到“猎物”载体pDL2-Nx上。然后将连接好的载体对pTMBV4-AtSUC4/pDL2-Nx-cDNA共转化到受体酵母菌株DSY-1中,在缺乏色氨酸、亮氨酸和组氨酸,并添加了100mmol.L-3-AT的SD筛选平板上筛选培养。最后,获得了拟南芥蔗糖转运蛋白AtSUC4的互作因子:拟南芥光系统Ⅰ亚基H(PsaH)。这是目前世界上发现的第一个定位于叶绿体上的拟南芥蔗糖转运蛋白AtSUC4的互作因子。
将AtSUC4和AtPsaH基因分别连接到Bimolecular Fluorescence Complementation(BiFC)的载体上,共转化拟南芥原生质体,通过激光共聚焦显微镜观察,在原生质体的叶绿体上观察到了黄色荧光,因此验证了拟南芥蔗糖转运蛋白AtSUC4和PsaH的体内互作,并且将其互作部位定位在叶绿体上。