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目的:嵌合抗原受体T细胞（Chimeric Antigen Receptor T Cell,CAR-T）疗法是一种以嵌合型抗原受体（CAR）为基础的细胞免疫疗法。该疗法在血液肿瘤的治疗中已取得了显著进展,但在治疗实体瘤方面仍然面临许多挑战,包括实体瘤复杂的肿瘤微环境、各种免疫抑制机制以及特异性肿瘤抗原的缺乏等都可能会阻碍CAR-T细胞对实体瘤的治疗。此外,CAR胞内信号的有效传递也是CAR-T细胞完全活化并发挥最佳细胞毒活性的重要前提。T细胞激活和增殖需要多种信号参与,包括T细胞受体（T cell receptor,TCR）（信号1）,共刺激信号（信号2）和细胞因子（信号3）。在本研究中,我们以含有CD28共刺激信号的第二代CAR作为主体框架,构建了靶向HER2的3种不同的HER2-CAR:1)H28ξ（经典的二代CAR,含有CD3ξ和CD28的胞内区）;2)H28ξ（YRHQ）,即在CD3ξ链末端引入YRHQ基序;3)H28-△IL-2Rγ-ξ（YRHQ）,即在CD28胞内区和CD3ξ之间插入截短的IL-2Rγ结构域。利用这3种带有不同信号分子结构域的HER2-CAR,制备了3种不同的HER2-CAR-T细胞,即H28ξ-CAR-T、H28ξ（YRHQ）-CAR-T及H28-△IL-2Rγ-ξ（YRHQ）-CAR-T。利用体外培养HER2阳性的SKOV3、MDA-MB-453及HER2阴性的MCF-7肿瘤细胞作为靶细胞,观察了3种HER2-CAR-T细胞对靶细胞的特异性识别和杀伤活性,比较了不同CAR-T细胞的表型差异。目的是探索引入YRHQ基序和/或△IL-2Rγ信号分子,能否提高HER2-CAR-T细胞的胞内信号以及对肿瘤细胞的靶向杀伤活性。方法:1.构建重组慢病毒表达载体pCDH-HER2-CAR。应用分子克隆技术将南京金斯瑞生物技术有限公司合成的3种编码CAR的DNA片段,即H28ξ、H28ξ（YRHQ）、H28-△IL-2Rγ-ξ（YRHQ）,经Eco R I、Bam H I双酶切,克隆到pCDH-CMV-GFP慢病毒表达载体,然后经双酶切进行鉴定。2.包装pCDH-HER2-CAR慢病毒颗粒。体外培养293T细胞,将包装质粒p LP-1、p LP-2、p LP-VSVG和目的质粒pCDH-HER2-CAR共转染293T细胞。分别在感染48h和72h,收集病毒上清,经超速离心法浓缩慢病毒。然后将浓缩慢病毒以不同体积感染293T细胞,流式细胞术检测各慢病毒感染293T细胞的GFP阳性率,计算病毒滴度。3.人外周血T淋巴细胞的分离、激活。取健康人外周血,密度梯度离心法分选人外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）,用CD3磁珠从PBMCs中分选人CD3阳性T细胞;流式细胞术检测分选的CD3阳性T细胞的纯度。4.优化T细胞的激活条件、感染条件和感染复数。最终选取T细胞的激活条件:含5μg/ml的固化CD3m Ab（OKT3）、0.5μg/ml的游离CD28m Ab、终浓度为10ng/ml的rh IL-2和rh IL-7的RPMI 1640完全培养基、在37℃、5%CO2培养箱培养48h。感染条件:HER2-CAR慢病毒感染T细胞,24℃、2500rpm离心90min,37℃、5%CO2培养箱培养12-16h后更换T细胞培养基。感染复数（Multiple of infection,MOI）为50。5.HER2-CAR-T细胞的制备。HER2-CAR慢病毒（MOI=50）感染活化的T细胞,4d后,取3种HER2-CAR-T细胞经Biotin-Protein L（与sc Fv中的κ链结合）和PE Streptavidin染色,流式细胞术检测HER2-CAR-T细胞中CAR的表达率。6.肿瘤细胞的培养及表型鉴定。体外培养SKOV3、MDA-MB-453、MCF-7细胞,细胞免疫荧光技术检测细胞表面HER2的表达。7.T细胞增殖检测。分别在慢病毒感染T细胞后第1d、第3d、第5d及第7d,利用细胞计数板对3种HER2-CAR-T细胞进行计数,同时计数未转染T细胞（Non-transduced T cell,NT T）,了解T细胞的增殖情况。8.HER2-CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性测定。8.1 HER2-CAR-T细胞的细胞毒活性检测。HER2-CAR-T细胞在体外增殖8d,静息2d后,分别以20:1、10:1、5:1和1:1的效靶比与SKOV3、MDA-MB-453和MCF-7 3种靶细胞共培养16h,LDH释放实验检测HER2-CAR-T细胞的杀伤活性。8.2 HER2-CAR-T细胞分泌IL-2、IFN-γ和GZMB的水平。HER2-CAR-T细胞在体外增殖8d,静息2d后,以10:1的效靶比分别与SKOV3、MDA-MB-453、MCF-7细胞共培养24h,ELISA法检测培养上清中IL-2、IFN-γ以及GZMB的水平。8.3 HER2-CAR-T细胞转录因子STAT3磷酸化水平。HER2-CAR-T细胞在体外增殖8d,静息2d后,以5:1的效靶比与SKOV3细胞共培养4h,Western blot检测转录因子STAT3的磷酸化水平。8.4 HER2-CAR-T细胞免疫检查点分子TIM-3、PD-1的表达。HER2-CAR-T细胞在体外增殖8d,静息2d后,以5:1的效靶比与SKOV3细胞共培养24h,Western blot检测HER2-CAR-T细胞中检查点分子TIM-3和PD-1的表达水平。9.HER2-CAR-T细胞的表型分析。HER2-CAR-T细胞在体外增殖8d,静息2d后,流式细胞术检测HER2-CAR-T细胞表面CCR7、CD45RO的表达,分析初始T细胞（Na（?）ve T cell,TN）CCR7+CD45RO-、效应T细胞(Effector T cell,TEFF)CCR7-CD45RO-、中央记忆T细胞(Central memory T cells,TCM)CCR7+CD45RO+及效应记忆T细胞(Effector memory T cells,TEM)CCR7-CD45RO+等不同亚型T细胞的分布。同时,将上述回复静息的HER2-CAR-T以5:1的效靶比与SKOV3细胞共培养24h,同上检测CAR-T细胞的表型变化。结果:1.成功构建了靶向HER2的3个重组表达载体pCDH-H28ξ、pCDH-H28ξ（YRHQ）和pCDH-H28-△IL-2Rγ-ξ（YRHQ）。2.流式细胞术结果显示,1μl浓缩后的携带H28ξ-CAR、H28ξ（YRHQ）-CAR或H28-△IL-2Rγ-ξ（YRHQ）-CAR的慢病毒感染293T细胞后,GFP的表达率分别为:34.35%、33%、38.99%,计算的病毒滴度分别为:1.72×108、1.65×108、1.95×108。3.流式细胞术结果显示,CD3阳性T淋巴细胞的纯度达94.3%。4.流式细胞术结果显示,H28ξ-CAR-T、H28ξ（YRHQ）-CAR-T和H28-△IL-2Rγ-ξ（YRHQ）-CAR-T细胞中CAR的表达率分别为:33.3%±2.85%、28.30%±3.2%、34.57%±3.3%。5.细胞免疫荧光结果显示,SKOV3细胞和MDA-MB-453细胞表面表达HER2抗原,MCF-7细胞表面不表达HER2抗原。6.通过细胞计数,3种HER2-CAR-T细胞在体外增殖无统计学差异。7.HER2-CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性7.1通过LDH释放法观察到,与NT T相比,在效靶比5:1、10:1和20:1的情况下,H28ξ-CAR-T、H28ξ（YRHQ）-CAR-T和H28-△IL-2Rγ-ξ（YRHQ）-CAR-T对HER2阳性的SKOV3或MDA-MB-453细胞均表现出明显的杀伤活性（P<0.05或P<0.01）。其中,H28ξ（YRHQ）-CAR-T的杀伤活性最强,与其它2种HER2-CAR-T细胞相比,也均有显著性差异（P<0.05）,而H28-△IL-2Rγ-ξ（YRHQ）-CAR-T细胞的杀伤活性明显低于H28ξ-CAR-T细胞（P<0.05）。对于HER2阴性的MCF-7细胞,3种HER2-CAR-T细胞的杀伤活性较低,且无明显差异。7.2 ELISA结果显示,与NT T细胞相比,3种HER2-CAR-T细胞与SKOV3或MDA-MB-453细胞共培养后,IL-2、IFN-γ的分泌水平均明显提高（P<0.05或P<0.01）;H28ξ-CAR-T细胞、H28ξ（YRHQ）-CAR-T较H28-△IL-2Rγ-ξ（YRHQ）-CAR-T和NT T细胞分泌更高水平的GZMB（P<0.05或P<0.01）。7.3 Western blot结果显示,含YRHQ基序的H28ξ（YRHQ）-CAR-T细胞和H28-△IL-2Rγ-ξ（YRHQ）-CAR-T细胞经HER2抗原刺激后,转录因子STAT3的磷酸化水平均明显升高（P<0.01）。7.4 Western blot结果显示,3种HER2-CAR-T细胞经HER2抗原刺激后,TIM-3的表达无统计学差异;H28-△IL-2Rγ-ξ（YRHQ）-CAR-T细胞较NT T或其它2种HER2-CAR-T细胞的PD-1表达水平明显升高（P<0.05）。8.流式细胞术结果显示,经CD3/CD28双抗体激活后,静息2d的3种CAR-T细胞的CCR7、CD45RO的表达均没有明显差异（均为P>0.05）。与HER2阳性SKOV3肿瘤细胞共培养后,H28ξ（YRHQ）-CAR-T和H28-△IL-2Rγ-ξ（YRHQ）-CAR-T细胞中TEM细胞,较NT T与H28ξ-CAR-T比较明显增加（P<0.05）,而中枢记忆细胞明显减少（P<0.05）。H28ξ-CAR-T细胞亚群与NT T没有明显区别。结论:1.HER2-CAR-T细胞对HER2阳性的SKOV3或MDA-MB-453肿瘤细胞显示出特异性杀伤活性。2.CD3ξ（YRHQ）基序能诱导CAR-T细胞中转录因子STAT3磷酸化,从而提高CAR-T细胞的杀伤活性。3.H28-△IL-2Rγ-ξ（YRHQ）-CAR-T细胞表达PD-1水平升高,可能是导致该细胞衰竭的原因。4.H28ξ（YRHQ）-CAR-T细胞经HER2阳性的SKOV3细胞刺激后,TEM细胞亚群比例升高,在一定程度上可提高CAR-T细胞的增殖和杀伤潜力。