炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)是一种大型的革兰氏阳性杆菌，是引起人类及动物烈性传染病——炭疽的病原体。在自然界中炭疽杆菌主要以芽孢形式的存在于土壤、动物粪便和空气中，由于炭疽芽胞杆菌致命的致病力和炭疽芽孢对自然环境强大的抵抗力，炭疽一直是世界上研究最多分布最广的头号生物战剂。早期快速特异检测空气、土壤、水源以及可疑标本中的炭疽芽孢杆菌可以有效降低感染人群的死亡率、阻断病原的更大规模扩散，是国家防生应急体系的核心环节，具有非常重大的意义。 检测炭疽芽胞杆菌的方法主要有基于培养和生化鉴定的传统实验室方法、基于抗原抗体结合的免疫学方法和基于基因组特异序列的核酸检测方法。核酸检测方法特异性强，速度快，技术成熟，标本中的炭疽芽胞杆菌在生物安全实验室中进行核酸释放处理阶段通常被灭活，相对其它检测方法更安全。基于TaqMan探针技术的实时定量PCR方法检测灵敏度高、结果稳定，引物、探针和模板序列之间的双重特异性克服了传统PCR的缺陷，是炭疽芽胞杆菌的快速检测比较理想的技术手段。 一种核酸检测方法通常面临的核心问题是如何选择针对检测物种特异的核酸检测靶点。不同于其它菌种，炭疽芽胞杆菌与自然界中广泛分布的腊样芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌等菌种同属于腊样芽胞杆菌群，这些近源菌种在核酸水平具有相当高的同源性，传统的菌种鉴定标志如16sRNA序列、23sRNA序列、16/23sRNA间隔区序列在这些菌种之间仅具非常微小的差异，这决定了寻找炭疽芽胞杆菌染色体特异序列(genomicsignatures)具有较大的挑战性。早期的炭疽芽胞杆菌核酸检测方法大都选择炭疽芽胞杆菌携带的两个毒性质粒pX01和pX02作为特异检测靶点，但是毒性质粒并不稳定，容易缺失，转移和突变。大量研究已经证明，尽管炭疽芽胞杆菌和其近源菌种具有很高的同源性，但是它们的基因组序列之间确实存在散在分布的差异序列。因此，在相对保守的染色体上寻找、选择炭疽芽胞杆菌独有的特异序列(genomicsignatures)作为检测靶点，再利用高度敏感特异的荧光定量PCR技术建立炭疽芽胞杆菌核酸检测方法，既可以提高检测的特异性，又可以克服以往仅依靠毒性质粒pX01和pX02的检测方法的局限性。因此，该方法近年来被广泛应用于炭疽芽胞杆菌快速检测，一些染色体特异检测序列也见诸报道，但后续研究相继证实这些序列的检测灵敏度、特异性以及检测速度不够理想。为了寻找新的炭疽芽胞杆菌染色体特异检测序列，本研究从117段炭疽芽胞杆菌染色体特异序列中筛选出6段最优序列，设计TaqMan探针和引物，建立了一种快速、准确、特异定量检测炭疽芽胞杆菌的新方法 一、炭疽芽胞杆菌染色体特异序列的筛选及验证。 对文献报道的共117段炭疽芽胞杆菌染色体特异序列进行两次筛选。首先利用NCBIBLAST-tn比对所有候选序列，筛选出完全符合GenBank数据库中炭疽芽胞杆菌基因组数据的候选序列。序列入选条件：与GenBank中炭疽芽胞杆菌基因组具100％同源性(BLASTE-value=0)；与其它物种尤其是炭疽芽胞杆菌近源菌种不具有或仅具极低同源性(BLASTE-value≥0.1)，符合条件的序列可认为具有较理想的理论特异性。其次，为了得到适合TaqMan实时定量PCR检测方法目标序列，在满足特异性的基础上还必须根据TaqMan复合探针和引物的设计的原则，对这些序列进行二次筛选。由于第一次筛选中得到的部分特异片段长度较短(小于200bp)，难以同时找出理想的引物对和探针，根据GenBank中炭疽芽胞杆菌全基因组序列向其3’和5’端各延伸200bp得到600bp左右的加长序列(expandedsequence)，并再次利用第一步的筛选方法和入选条件验证这些加长序列的特异性。最终共从117段候选序列中得到了11段具有100％同源性和8段具有99％以上同源性的炭疽芽胞杆菌基因组特异序列。根据TaqMan探针和引物设计条件从11段100％特异序列中筛选出6段(C01-C06)既满足炭疽芽胞杆菌特异性又符合TaqMan探针和引物设计原则的特异序列。利用Oligo6.0软件人工设计6段特异序列及pagA基因、capB基因的TaqMan探针和引物，所有探针、引物及理论扩增片段序列再经BLAST-tn验证具100％特异性。 二、炭疽芽胞杆菌常规PCR、双重PCR、实时荧光定量PCR检测方法的建立及模拟污染标本的检测 为了验证所设计引物的特异性和灵敏性，并从6套基因组特异序列引物探针中选择一套相对较好的方案用于实时定量检测，将所有8对引物(C01～C06片段、pagA、capB)分别对不同浓度、不同方法抽提的炭疽芽胞杆菌基因组DNA及其它近源菌株基因组DNA进行常规PCR反应，经多轮反应条件优化后选定特异性较好，扩增效果稳定的C04片段用于定量PCR检测方法；进一步对基于C04片段与capB、pagA基因的双重及多重PCR的反应条件和检测结果进行优化和分析，建立了C04片段与capB基因的双重PCR检测体系。继而利用C04片段与炭疽芽胞杆菌毒性质粒pX01、pX02上的pagA、capB基因建立实时定量PCR检测体系。经实验证实本体系的检测灵敏度达到每PCR反应10～100个拷贝，利用12种相关菌株评价后获得100％特异性。在此基础上利用10份炭疽芽胞杆菌污染的生活用水和土壤标本以及20份对照标本验证本体系的检测能力，结果显示所有污染标本均被检出，所有对照标本均为阴性。 小结： 1.本实验筛选117段炭疽芽胞杆菌特异序列，经双重特异性验证后得到19段比较理想的炭疽芽胞杆菌特异序列，根据TaqMan探针引物设计原则选择其中6段设计TaqMan实时定量PCR检测方案。 2.经常规PCR和双重PCR实验，优选其中的C04片段建立了TaqMan荧光定量PCR检测体系。经实验验证，本体系具有较理想的检测灵敏度和特异性，整个检测过程可以在4小时以内完成，而基于C04、capB基因序列建立的双重PCR检测体系不仅可以用作一种基于普通PCR仪的检测方法，更为进一步研究炭疽芽胞杆菌多重实时定量PCR检测方法奠定了基础；此外，C04片段作为一种全新的特异序列用于炭疽芽胞杆菌实时定量PCR检测，国内外均未见报道。研究得到的19段炭疽芽胞杆菌特异序列除了可以用于继续研究基于TaqMan探针技术炭疽芽胞杆菌定量检测方法外，还有望应用于制备高通量的炭疽芽胞杆菌检测基因芯片等研究领域。