论文部分内容阅读
目的： 1.拟证实自噬信号转导网络在CD的自噬与免疫调节机制中的作用及隔药灸对其影响的研究。 2.阐明隔药灸通过调节LKB1-mTOR-PI3KC信号转导网络，抑制CD结肠组织过度活化的自噬，抑制肠道炎症，以达到纠正克罗恩病结肠黏膜病变之目的，为隔药灸治疗CD效应机制研究提供科学依据。 方法： 1.将雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、隔药灸组、对照灸组、西药组、生理盐水组，应用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)灌肠法制备大鼠CD模型。隔药灸组对CD模型大鼠进行隔药灸天枢（双）、气海治疗;对照灸组对正常大鼠进行隔药灸天枢（双）、气海穴进行干预;西药组对CD模型大鼠进行美沙拉嗪肠溶片灌胃治疗;生理盐水组对CD模型大鼠进行0.9％生理盐水灌胃干预。通过对各组的大鼠大体情况、结肠病变肉眼评分、结肠组织病理学改变及组织病理学评分的观察隔药灸治疗CD的效应;通过采用RNA-seq高通量测序和生物信息学分析筛选自噬、免疫相关因子的表达谱，分析与CD密切相关的信号通路。 2.将雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、隔药灸组、对照灸组、西药组、生理盐水组，干预方法同第一部分，结合RNA-seq测序结果，通过采用RT-qPCR、Western blot、免疫组化技术与方法，检测各组的大鼠结肠组织中自噬相关基因Beclin1、LC3Ⅱ、Atg16L1、NOD2和IRGM的表达，检测免疫炎症相关分子IL-1β、IL-17和TNF-α的表达;采用免疫荧光的方法检测自噬关键蛋白LC3Ⅱ、自噬货车蛋白SQSTM1/p62在结肠组织中的分布与表达，观察隔药灸对CD大鼠结肠组织的自噬活性的作用，以及对免疫炎症相关分子表达的调控。 3.实验动物分组及干预方法同前，在明确了隔药灸对CD的自噬、免疫调节作用，再采用RT-qPCR、Western blot，检测各组的大鼠结肠组织中自噬相关信号转导网络分子LKB1、PI3KC、AKT、mTOR的表达，观察隔药灸是否通过调控其相关信号转导网络，而发挥抑制CD大鼠结肠组织中过度活化的自噬作用。 结果： 1.各组CD大鼠结肠病理组织学评分比较:与模型组比较，正常组、隔药灸组和对照灸组的结肠病理学评分均有显著降低，差异均有统计学意义(P均＜0.001);与正常组比较，隔药灸组、西药组和生理盐水组的大鼠结肠病理学评分均有显著升高，差异均有统计学意义（P均＜0.001）。 2.采用RNA-seq高通量测序和生物信息学分析筛选CD自噬、免疫相关因子的表达谱:西药组、生理盐水组与模型组比较基因差异性较小，隔药灸组与正常组基因表达的相似性较大。隔药灸组中参与CD发病且与自噬密切相关的NOD2基因、IRGM基因、Atg9b及免疫相关因子的表达均有不同程度的下调。 3.免疫组化和免疫荧光法检测CD大鼠结肠组织LC3Ⅱ、SQSTM1/p62的表达:与模型组比较，正常组、隔药灸组的大鼠结肠组织LC3Ⅱ的免疫组化和免疫荧光的表达均有显著降低，差异均有统计学意义（P均＜0.05）;与模型组比较，正常组、隔药灸组、对照灸组的大鼠结肠组织SQSTM1/p62的免疫组化和免疫荧光表达均有显著升高，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。 4.隔药灸对CD大鼠自噬相关蛋白表达的影响:与模型组比较，正常组、隔药灸组、对照灸组和西药组的大鼠结肠组织LC3Ⅱ蛋白表达均有所降低，差异均有统计学意义（P均＜0.001）;与模型组比较，正常组、隔药灸组和对照灸组的大鼠结肠组织SQSTM1/p62蛋白的表达均有所升高，差异均有统计学意义(P均＜0.05);与模型组比较，正常组、隔药灸组、对照灸组和西药组的大鼠结肠组织Beclin1蛋白表达均有所降低，差异均有统计学意义（P均＜0.001）;与模型组比较，正常组、隔药灸组、对照灸组和西药组的大鼠结肠组织Atg16L1、NOD2、IRGM蛋白表达均有显著降低，差异均有统计学意义（P均＜0.001）。与隔药灸组比较，生理盐水组的大鼠结肠组织Atg16L1、NOD2、IRGM蛋白表达有显著升高，差异有统计学意义（P均＜0.01）。 5.隔药灸对CD大鼠IL-1β、IL-17和TNF-α表达的影响:IL-1β:与模型组比较，正常组、隔药灸组、对照灸组、西药组和生理盐水组的大鼠结肠组织IL-1βmRNA和蛋白的表达均有所降低，差异均有统计学意义（P均＜0.05）;与隔药灸组相比，西药组和生理盐水组的大鼠结肠组织IL-1β mRNA和蛋白表达均有所升高，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。IL-17:与模型组比较，正常组、隔药灸组和对照灸组的大鼠结肠组织IL-17mRNA和蛋白的表达均有所降低，差异均有统计学意义（P均＜0.05）;与隔药灸组相比，生理盐水组的大鼠结肠组织IL-17mRNA表达有所升高，差异具有统计学意义（P＜0.05），对照灸组、西药组和生理盐水组的大鼠结肠组织IL-17蛋白表达均有所升高，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。TNF-α:与模型组比较，正常组、隔药灸组、对照灸组和生理盐水组的大鼠结肠组织TNF-α mRNA和蛋白的表达均有所降低，差异均有统计学意义(P均＜0.05);与隔药灸组相比，西药组的大鼠结肠组织TNF-α mRNA表达有所升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，西药组和生理盐水组的大鼠结肠组织TNF-α蛋白表达均有所升高，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。 6.隔药灸对LKB1-mTOR-PI3KC信号转导网络通路关键分子表达的影响:PI3KC:与模型组比较，正常组、隔药灸组和对照灸各组的大鼠结肠组织PI3KCmRNA表达均有显著降低，差异均有统计学意义（P均＜0.05）;与隔药灸组比较，西药组的大鼠结肠组织PI3KC mRNA表达有所升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。AKT1:与模型组比较，正常组、隔药灸组、对照灸组、西药组和生理盐水组的大鼠结肠组织AKT1 mRNA表达均有所降低，差异均有统计学意义（P均＜0.05）;与隔药灸组比较，西药组的大鼠结肠组织AKT1 mRNA表达有所升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。LKB1:与模型组比较，正常组、隔药灸组和对照灸组的大鼠结肠组织LKB1 mRNA表达均有所降低，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。mTOR:与模型组比较，正常组、隔药灸组、对照灸组和西药组的大鼠结肠组织mTOR蛋白的表达均有所升高，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。 结论： 1.隔药灸可通过调节大鼠结肠组织的自噬、免疫相关的基因表达谱，调控与CD密切相关的信号通路，有效缓解TNBS诱导的克罗恩病大鼠的肠道炎症，促结肠组织损伤的修复。 2.克罗恩病大鼠结肠组织自噬活化，且自噬流发生，自噬底物进行降解为其主要发病机制之一;CD大鼠LKB1-mTOR-PI3KC信号转导网络中上游因子PBK、AKT1、LKB1均被激活，可抑制mTOR的活性，与CD大鼠自噬的发生密切相关。 3.隔药灸“天枢、气海”，可明显抑制克罗恩病大鼠结肠组织中过度活化的自噬，调节机体免疫相关因子IL-1β、IL-17和TNF-α的表达，抑制肠道炎症。 4.隔药灸“天枢、气海”，隔药灸抑制克罗恩病大鼠结肠组织中过度活化的自噬，是通过对LKB1-mTOR-PI3KC信号转导网络调控发挥作用的，继而缓解了克罗恩病大鼠的肠道炎症。