益气健脾药药性多为甘温,中药配伍减毒理论认为甘能缓能和,能够制约附子、马钱子等有毒药物的毒性和峻烈之性。现代医学理论认为配伍减毒的理论依据为中药进入体内,经过生物转化后以原形或代谢物存在,且二者比例变化与其配伍存在一定对应关系。因此,配伍减毒的机理不单是药物固有的药理药剂性质的变化,更表现在药物生物药剂学性质的相互影响上。课题组前期已有研究表明,黄芪能通过抑制毒性中药活性成分的肠吸收降低其毒性,那么配伍引起活性成分代谢的变化是否是其减毒的另一个生物药剂学环节,益气健脾药白术能否产生相同的效应呢,因此,本文将从甘缓配伍理论的机制进行考察,选用黄芪-附子、白术-马钱子为模型,通过模型药配伍和对毒性中药吸收、代谢及药代动力学的影响着手,进一步研究其配伍减毒机理,发掘益气健脾药配伍应用的共性与个性,阐明中药配伍理论的科学内涵。1.黄芪活性成分对附子生物碱的Ⅰ相酶代谢动力学的影响考察本章采用体外孵育技术,以附子6种生物碱为考察对象,利用底物消除法考察毛蕊异黄酮和黄芪甲苷对附子生物碱在大鼠和人肝微粒体中的酶代谢动力学影响。结果显示,附子生物总碱在人肝微粒体中代谢参数Km、Vmax和Clint分别为62.51μM、1.33μmol/(min?mg protein)、0.021min/mg,且随着毛蕊异黄酮和黄芪甲苷浓度的增加,附子生物碱代谢率也随之降低,Vmax、Km和Clint也显著下降,表明黄芪甲苷和毛蕊异黄酮可抑制附子生物碱的代谢,有效减缓附子在肝脏中的清除。同时,6种生物碱均经过Ⅰ相代谢酶代谢,可以进一步开展关于附子生物碱的Ⅰ相代谢研究。2.附子代谢表型研究为了阐明附子代谢机制,进一步了解药物在生物体内的生物转化及预测药物相互作用,同时为附子临床安全合理用药提供理论依据,本试验应用LC-MS技术,结合化学抑制剂法和重组酶孵育法,两种方法共同鉴定参与对附子6种生物碱RLM/HLM代谢的CYP450酶表型。化学抑制剂试验结果显示,除CYP2D6抑制剂对BAC、CYP1A2抑制剂对BAC、HA、CYP2C19抑制剂对BHA、MA、AC,CYP2C9抑制剂对HA抑制率较低外,6种生物碱的代谢转化率均随5种选择性抑制剂的增加有明显下降,以CYP3A4最为显著,抑制率约为30%。与CYP450重组酶的温孵反应中,随着反应时间的增加,6种生物碱均可被重组酶CYP3A4和CYP2D4消除,CYP1A2可催化3种双酯型生物碱和BHA消除,CYP2C19可消除BHA、MA、AC,CYP2C19可代谢MA、AC。综合化学抑制剂和c DNA重组酶试验表明附子6种生物碱均可经CYP3A4代谢,CYP2D6参与了BHA、BMA、HA、MA的代谢,CYP1A2参与AC的代谢,CYP2C9参与MA和AC的代谢,CYP2C19参与BHA和MA的代谢。3.毛蕊异黄酮和黄芪甲苷代谢表型及毛蕊异黄酮对CYP450酶活性影响研究为了进一步探讨黄芪抑制附子代谢机理,本章首先进行了黄芪活性成分毛蕊异黄酮和黄芪甲苷的代谢表型研究,发现毛蕊异黄酮主要由CYP3A4、CYP2D6、CYP1A2代谢,而黄芪甲苷的代谢仅有前两种亚型酶参与。以不同浓度毛蕊异黄酮与探针药物在大鼠和人肝微粒体中共孵育,观察毛蕊异黄酮对各酶的作用情况,结果在两种肝微粒体中,毛蕊异黄酮对酶活性的影响明显不同,尤其是CYP3A4酶,在大鼠肝微粒体中为诱导作用,诱导率为20%,而在人肝微粒体中却相反,其余4种亚型酶在大鼠和人肝微粒体中均被抑制,但抑制程度不同。毛蕊异黄酮对人肝微粒体中CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4酶有一定抑制作用,IC50值分别29.8、87.2、40.12μM,对CYP1A2、CYP2D6的IC50值大于100μM,抑制作用较弱。IC50 Shift试验中,毛蕊异黄酮对人肝微粒体的抑制为可逆性抑制,抑制类型研究结果显示,发现它对CYP1A2为反竞争性抑制,对CYP2C19、CYP2C9为非竞争性抑制,对CYP2D6为竞争性抑制,对CYP3A4为竞争性抑制,Ki值分别为61.2、85.0、30.0、65.0和24.9μM,结合IC50和Ki值可以看出,毛蕊异黄酮不易于与其他药物发生相互作用,且会与附子生物碱竞争CYP3A4酶代谢。毛蕊异黄酮和黄芪甲苷代谢表型及毛蕊异黄酮对CYP450酶活性影响研究结果表明毛蕊异黄酮能够通过抑制CYP酶活性,或和附子竞争CYP3A4酶,相对减少附子生物碱的代谢,这将导致血药浓度升高,不利于减附子毒性。4.黄芪对附子生物碱药代动力学影响研究黄芪能同时抑制附子的吸收和代谢,这对于体内血药浓度会产生相反的效应,因此本章采用LC-MS法测定大鼠单次给药后不同时间血浆中药物浓度,研究黄芪-附子配伍对附子6种生物碱的大鼠药代动力学的影响。并运用DAS 3.3求算药物的药代动力学参数,SPSS 13.0软件分析附子配伍黄芪前后主要药动学参数差异。结果配伍黄芪后,6种生物碱的AUC(0-t)和AUC(0-∞)均显著降低,除HA外的5种生物碱的CLz/F升高;3种单酯型生物碱Cmax降低,Tmax延长;BMA和MA的分布容积(Vz/F)增大。表明黄芪可以抑制附子生物碱的吸收,诱导附子生物碱向全身分布,并加快附子生物碱在体内的消除。5.白术抑制马钱子吸收的机理研究在前期研究白术可抑制马钱子吸收,且马钱子中马钱子碱和士的宁的转运方式以被动转运为主的基础上。本章首先运用Caco-2细胞Transwell跨膜转运模型研究了马钱子活性成分的吸收机理,结果显示,加入LPS、EDTA-2Na两种紧密连接开放剂和P-gp抑制剂后,BRU和STR的Papp均有显著性增加,说明马钱子中BRU和STR的吸收机制可以通过细胞旁途径吸收转运,且其被动转运的易化扩散过程主要由P-糖蛋白介导。紧接着利用Western blot技术考察了白术水提取物对Caco2细胞中外排转运蛋白(P-gp、Mrp2、Bcrp)和紧密连接蛋白(Claudin-1、Occludin、ZO-1)的蛋白表达的影响,WB结果表明,白术对6种吸收相关蛋白的表达均表现为上调作用,其中除白术低剂量对Mrp2和Claudin-1的表达没有显著性差异外其余各组均具有显著性差异。由此我们可以推断,白术可以通过上调控外排转运蛋白和紧密连接蛋白的表达,增强吸收屏障作用,阻止马钱子经p-gp介导的易化扩散以及细胞旁途径的跨膜转运过程,从而影响马钱子的血药浓度及药效。本课题从吸收、代谢及体内药动学的角度研究了益气健脾药对有毒药物的减毒机制,进一步阐明了黄芪-附子、白术-马钱子配伍原理,初步了解了益气健脾药配伍应用的共性与个性,为益气健脾药开发成新制剂提供了思路。