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发菜(Nostoc flagelliforme Born.)是一种世界性分布的陆生经济蓝藻,具有重要的经济和生态价值,是国家一级保护植物。本文运用蛋白质组学的方法和技术,研究了不同干旱胁迫处理下发菜蛋白质组的变化情况,掌握了与发菜抗旱相关的差异蛋白,并揭示了其生物学功能;同时运用植物生理学的理论和方法,研究了发菜在不同干旱胁迫处理下的渗透调节物质、保护酶活性等方面的生理变化情况。旨在探索差异蛋白质与发菜抗旱性之间的关系,为从分子水平揭示发菜的抗旱机制奠定了基础。研究结果概括如下:
1.研究了发菜在不同干旱胁迫处理下脯氨酸、丙二醛的含量变化以及超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶的活性变化,结果表明:随干旱胁迫的加重,脯氨酸含量和丙二醛含量不断增加,超氧化物歧化酶和过氧化物酶活性随干旱胁迫的加重先升高后降低,过氧化氢酶活性随着干旱胁迫的加重显著降低;
2.为建立适用于发菜蛋白质组研究的双向电泳技术,对发菜蛋白质的提取、裂解液中硫脲的浓度以及蛋白上样量等关键步骤进行了优化,结果表明:采用改良TCA法可提高提取液中蛋白质的含量和双向电泳图谱的分辨率,裂解液中含2M硫脲,24cmIPG胶条上样量为1.3mg时不仅提高了蛋白质的溶解性,而且改善了双向电泳的分离效果,得到近800个蛋白点,且蛋白点清晰,图谱分辨率较好。
3.采用双向电泳技术和生物质谱技术研究了发菜在不同干旱胁迫条件下的蛋白质差异表达情况。结果表明:在发菜含水量为661%的条件下检测到819个蛋白点,含水量为423%的条件下检测到724个蛋白点,含水量为88.1%的条件下检测到618个蛋白点,含水量为6.9%的条件下检测到769个蛋白点;经Image Master2D图像软件分析表达量变化在2倍以上的差异蛋白质有31个,其中4个呈上调表达,20个呈下调表达,7个呈波动变化;经MALDI-TOF-TOF/MS质谱分析和蛋白质数据库检索,有23个差异表达的蛋白质得到鉴定,分别为具有类成束蛋白重复结构的分泌蛋白和表面蛋白(Spot.2,7)、隔相关蛋白(Spot.5)、藻蓝蛋白-1-β链(Spot.6)、抗氧化蛋白(Spot.8,11)、锰过氧化氢酶(Spot.10)、超氧化物歧化酶(Spot.20,26)、DNA结合类铁蛋白(Spot.22,23,24)、谷氨酰胺合成酶(Spot.14)、果糖/塔格糖二磷酸醛缩酶(Spot.17,18)、半乳糖变旋酶和相关酶(Spot.19)、预测的参与胁迫反应的膜GTP酶(Spot.15)、D-丙氨酸-D-丙氨酸连接酶(Spot.16),还有5个未知蛋白。这些差异蛋白质主要参与发菜体内的抗氧化代谢、糖代谢、氮代谢、蛋白质合成等功能,这些研究结果和数据具有创新性,为进一步研究发菜抗旱的分子机制奠定了方法学和理论基础。