论文部分内容阅读
我国是世界水产大国，将转基因等现代生物技术引入传统的水产养殖中，已成为必然的发展趋势。现代生物技术，在观赏水族业中，更具应用前景。随着组织特异性启动子研究的深入，用荧光基因构建重组子，并转入鱼受精卵中，获得在不同部位发荧光的转基因观赏鱼技术已经得到初步应用。本研究所用到的单聚体绿色荧光蛋白（AcGFP）是一种新颖的报告基因，来源于水母体内蓝色发光蛋白质，是EGFP荧光蛋白质的变异体。与单聚体GFP的氨基酸有94％的同源性。可在体外或正在发育的胚胎或成体的原位方便地进行实时观察。
肌动蛋白（actin）是微丝的结构成分，分子量为43kD。斑马鱼的α-actin1基因位于其第17号染色体上，所调控的α-肌动蛋白1为骨骼肌所特有。本研究利用PCR技术，从斑马鱼基因组DNA中分离了斑马鱼α-肌动蛋白1（α-actin1）基因的启动子及其上游调控序列片段（2019bp）。序列分析表明，该启动子所在区域片段序列与NCBI网上公布的α-actin1基因5’侧翼区相应序列的相似性为98.7％，经进一步分析，在67位发现了100％MEF2顺式调控序列元件，在47位、1078位和1636位发现了88.9％MEF2顺式序列调控元件。在370位、679位以及802位发现了三个E顺式序列盒调控元件，MEF2盒，E盒等都对肌肉表达起调控作用。分析还发现，在所得序列的1667位点上发现了在转录中起重要作用的TATA盒。根据第一个外显子起始的所在位点，分析软件初步确定了所得片段的1714位点的A为转录起始位点。
将分离得到的α-actin1基因启动子及其上游调控序列片段与AcGFP荧光基因进行重组，得到α-actin1-AcGFP重组子。通过基因导入仪，将α-actin1-AcGFP重组子导入斑马鱼受精卵细胞核中，获得细肌丝（肌动蛋白）特异性表达的绿色荧光蛋白的转基因斑马鱼。为确定外源基因（acta1-AcGFP）的最佳注射浓度，本实验分别设置了100ng/ul、200ng/ul、300ng/ul、400ng/ul、500ng/ul五组不同外源DNA浓度并以TE溶液为阴性对照，导入斑马鱼受精卵中，观察荧光基因在斑马鱼仔鱼中的表达。根据统计学分析，初步确定外源基因（α-actin1-AcGFP）的最佳注射浓度为400ng/ul，荧光表达率平均为16.0％，在表达荧光的仔鱼中，有50％的鱼苗荧光强表达，此时荧光鱼苗畸形率为41.7％。对所得荧光鱼苗分别在出膜1天、出膜10天和出膜1个月进行观察。通过观察，发现荧光蛋白主要在骨骼肌中表达，且表达量随仔鱼肌肉的发育呈增长趋势。从仔鱼开始直到成鱼，在蓝光灯的照射下，绿色荧光均能通过肉眼直接观察。证明了分离得到的α-actin1启动子所在区域片段具有有效的驱动功能。
本实验用不连续SDS聚丙烯酰胺胶在蛋白水平分别对1月龄和3月龄表达荧光强的斑马鱼进行了荧光蛋白定量，通过估算，初步确定获得的1月龄和3月龄的荧光斑马鱼其荧光蛋白含量分别为1.05mg和3.5mg，分别占总体重（去内脏）的0.75％和0.83％。实验结果表明，荧光基因蛋白在斑马鱼体内的表达是呈增长趋势的。