研究背景:　　丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（Hepatitis CVirus，HCV）经血液、性传播、母婴传播感染等引起的一种传染性肝脏疾病。在世界范围内，丙肝病毒慢性感染者接近7100万(http://www.who.int/en/)。在慢性丙肝的治疗上，直接作用于丙肝病毒蛋白酶或聚合酶的小分子抑制剂(Direct Acting Antivirals，DAAs)应用于临床前，以聚乙二醇化干扰素(pegylated interferon alpha，PegIFNα)为基础联合利巴韦林(ribavirin，Rib)一直是疗效最佳的抗病毒方案，但仍然有部分病人不能产生持续性病毒应答。虽然目前在欧美国家上市的DAA联合治疗极大地提高HCV感染者的治愈率，但仍然存在大量的病毒耐药，广泛的毒副作用及药品价格昂贵等不足，并且HCV与乙型肝炎病毒(HBV)共感染者仍需要干扰素治疗。因此，在未来的一定时间内，以及某些地区，干扰素仍然是治疗丙肝病毒及乙肝病毒感染最常用的药物之一，特别是在亚洲国家，包括中国。　　Ⅰ型干扰素通过激活Jak/STAT信号传导通路，导致几百个干扰素刺激基因(ISGs)高表达。在这些ISGs中，很多具有抗病毒活性，是干扰素发挥抗病毒作用最重要的效应分子。然而，为了确保Jak/STAT信号传导通路不被过度激活，维持正常的稳态，在这些ISGs中存在一类干扰素信号通路负调控因子，包括USP18，SOCS等。这些负调控因子高表达，是造成干扰素治疗HCV和HBV等病毒感染疾病无效的原因之一。USP18(Ubiquifin Specific Protease18)是一种泛素特异性蛋白酶。通过与IFNAR2受体结合，USP18能阻断Ⅰ型干扰素信号通路(Jak/STAT)。因此，USP18是抑制Jak/STAT信号传导通路，防止该通路过度激活的关键蛋白之一。　　USP18高表达导致细胞耐受干扰素。通过基因芯片检测发现在治疗无效的丙肝病人治疗前肝组织内USP18高表达，应用siRNA降低USP18表达可以使干扰素抗病毒活性增强40-100倍。这提示USP18抑制了干扰素抗病毒活性。有意思的是，小鼠实验结果表明这种干扰素耐受依赖于USP18的高表达，但高表达USP18仅仅对IFNα产生耐受，对IFNβ的敏感性没有影响。因为IFNα和IFNβ都是通过结合到细胞表面同一个干扰素受体(IFNAR)而激活下游的Jak/STAT信号传导通路，USP18高表达小鼠肝细胞仅仅耐受IFNα而对IFNβ的敏感性正常，表明USP18与干扰素受体的亚基IFNAR2结合不能完全解释这种仅对IFNα的耐受现象。因此，进一步研究与USP18相互作用的宿主蛋白，对探索USP18高表达导致HCV耐受干扰素从而逃逸宿主的先天免疫攻击的分子机制具有非常重要的意义。　　研究目的:　　(1)筛选与USP18相互作用的宿主蛋白，并进一步确定他们相互作用的结构域。　　(2)与USP18相互作用的宿主蛋白对Jak/STAT信号通路的影响。　　(3)USP18与靶蛋白的相互作用对Jak/STAT信号通路的影响。　　(4)与USP18相互作用的宿主蛋白对HCV复制的影响以及对干扰素抗HCV活性的影响　　研究方法:　　1.采用免疫沉淀结合质谱的方法筛选与USP18相互作用的宿主蛋白。将带有Flag标签的USP18质粒以及相应空载体转染到293T细胞中，提取细胞总蛋白，经过anti-Flag M2affinity gel纯化，Flag-USP18以及与其相互作用的蛋白可以结合到树脂上。树脂经过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后考马斯亮蓝或银染进行染色。选取差异的条带进行质谱鉴定。　　2.选取筛选到的与USP18相互作用的宿主靶蛋白，在293T细胞和Huh7.5.1细胞中采用免疫共沉淀(Co-IP)的方法验证USP18与靶蛋白的相互作用，并进一步分段克隆，鉴定相互作用的结构域。　　3.研究与USP18相互作用的宿主蛋白对Ⅰ型干扰素信号通路的影响。在293T细胞和Huh7.5.1细胞中有高表达与USP18相互作用的宿主蛋白或采用siRNA降低这些宿主蛋白的表达，在干扰素(IFNa)刺激下，检测Jak/STAT通路激活情况（检测p-STAT1水平、ISRE活性、ISG的表达水平。　　4.研究USP18与宿主蛋白的相互作用对Ⅰ型干扰素信号通路的影响。在293T细胞和Huh7.5.1细胞中，分别单转USP18、USP18的靶蛋白以及共转USP18和其靶蛋白，在干扰素(IFNa)刺激下，检测p-STAT1水平和ISRE活性的变化。　　5.研究与USP18相互作用的宿主蛋白对HCV复制的影响以及对干扰素抗HCV活性的影响。在JFH-1HCVcc体外培养系统中，高转或knockdown USP18的靶蛋白，检测对JFH-1复制及干扰素抗HCV活性的影响　　研究结果:　　1.在293T细胞中，用免疫沉淀结合质谱的方法筛选到可能与USP18相互作用的宿主蛋白14个，分别是E3ubiquitin protein ligase HUWE1（HUWE1）;DNAdependent protein kinase catalytic subunit(DNA-PK);Fatty acid synthase(FAS);ribosomal protein S27a(RS27A);Insulin receptor substrate4(IRS4);ATP-dependent RNA helicase A(DHX9);Elongation factor2(EEF2);Tubulin beta chain(TUBB);Eukaryotic elongation factor1a1(eEF1a1);eukaryotic translation elongation factor1alpha2(eEF1α2);histone cluster2H2B family member e(H2B);histamine receptor H4;Chloride channel,nucleotide-sensitive,1A;Serum albumin。　　2.通过免疫共沉淀的方法验证了USP18与IRS4、NMEO、NME1L和eEF1a1存在相互作用。并且进一步用免疫共沉淀的方法验证了IRS4与USP18相互作用的结构域。　　3.在293T和Huh7.5.1细胞中高转IRS4质粒，发现IRS4促进IFNα介导的Jak/STAT信号通路的激活，表现在p-STAT1水平、ISRE活性及ISG表达水平均明显增强。siRNA抑制IRS4表达后，IFNα介导的Jak/STAT信号通路被抑制。　　4.在293T和Huh7.5.1细胞中分别高转USP18、IRS4和共转USP18和IRS4，结果显示USP18高表达抑制IFNα介导的Jak/STAT信号通路的激活，而IRS4高表达促进IFNα介导的Jak/STAT信号通路的激活。IRS4和USP18共转后，在IFNα刺激下，p-STAT1水平和ISRE活性恢复到对照组(仅加IFNα)水平，提示IRS4高表达促进IFNα介导的Jak/STAT信号通路的激活是通过与USP18相互作用实现的。　　5.在JFH-1HCV培养系统中，发现高转IRS4抑制JFH-1的复制，knockdown IRS4促进JFH-1的复制，并且高转IRS4促进IFNα的抗HCV活性。　　研究结论:　　IRS4是USP18相互作用的一个宿主蛋白，IRS4通过第335-400个氨基酸和第1094-1257氨基酸两个结构域与USP18C末端相互作用。IRS4与USP18的相互作用削弱了USP18对Jak/STAT信号通路的抑制作用。高表达IRS4可以促进IFNα介导的Jak/STAT信号通路的激活，相反knockdown IRS4可以抑制IFN刺激的Jak/STAT信号通路以及IRS4促进IFNa的抗HCV活性。