论文部分内容阅读
背景和目的： 食管癌(esophagealcarcinoma，EC)是世界上十大常见恶性肿瘤之一，潮汕地区尤其是南澳岛是食管癌高发地区。课题组前期研究发现食管癌变过程常伴随大量的慢性炎症，提示慢性炎症与食管癌的发生关系密切。慢性炎症产生大量的活性氧和活性氮(reactive oxygen and nitrogen species，RONS)可使DNA发生氧化损伤。DNA氧化损伤的累积可能导致机体正常细胞基因突变并向恶性转化。8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2’-deoxy-guanosine,8-OHdG)是DNA氧化损伤反应中最主要的产物，同时也是公认的检测DNA氧化损伤的生物学标记。亦有研究表明，在肿瘤细胞中NF-κB信号通路可以被ROS及其产物激活。 本研究通过检测8-OHdG在食管非癌组织中的表达，探讨DNA氧化损伤与食管慢性炎症、癌前病变的关系；用不同浓度的H2O2在体外刺激三株食管永生化上皮细胞(NE2、NE3、NE6)16 h后检测8-OHdG的表达，探讨在体外活性氧对食管永生化上皮细胞的影响；通过用800μM H2O2及10ng/ml humanTNF-α分别在体外用不同时间刺激NE细胞后检测NF-κB(p65)的表达，功能上探讨H2O2诱导食管永生化上皮细胞DNA氧化损伤的潜在机制。 材料与方法： 材料： 90例内镜活检食管非癌组织石蜡标本，收集自汕头大学医学院病理科。 19例尸检食管组织石蜡标本，收集自汕头大学司法鉴定中心。 3株食管永生化上皮细胞系(NE2、NE3、NE6)，由香港大学曹世华教授惠赠。 方法： 1、HE染色：观察食管非癌标本的上皮增生类型，炎症细胞浸润程度情况。 2、免疫组化：采用Envision两步法检测8-OHdG在食管非癌标本的表达。 3、细胞培养：利用H2O2、hTNF-α处理食管永生化上皮细胞。 4、免疫荧光：检测食管永生化上皮细胞在H2O2处理前后8-OHdG的表达；H2O2、hTNF-α处理前后NF-κB(p65)的表达。 5、利用MTT检测H2O2处理食管永生化上皮细胞的细胞活性。 6、图像采集：使用Leica DM2500及OLYMPUS BX43显微镜和IM50及cellSens Entry图像采集系统对染色结果进行拍照分析。 7、统计分析：利用SPSS19.0对实验数据进行统计分析，采用了等级相关分析、单因素方差分析等方法。论文图运用GraphPad Prism5制作。 研究结果： 1、炎症等级与食管粘膜上皮增生之间存在正相关(P<0.01)，Spearman相关系数rs=0.371。 2、随着炎症程度增加，8-OHdG的表达逐渐增强(P<0.05)。 3、食管黏膜从正常到增生的过程，8-OHdG的胞核表达逐渐增强(P<0.01)，且其表达与食管上皮增生等级成正相关，rs=0.486。 4、3株食管永生化上皮细胞活性随着H2O2处理浓度增加而降低。 5、400μM双氧水处理食管永生化上皮细胞16h，8-OHdG开始出现胞核表达。 6、800μM双氧水处理NE2细胞8h，NF-κB(p65)开始出现胞核表达。 7、10ng/mlhTNF-α处理NE2细胞10min，NF-κB(p65)开始出现胞核表达。 研究结论： 1、炎症越重，DNA氧化损伤越重，食管上皮增生级别越高。 2、H2O2可诱导食管永生化上皮细胞发生DNA氧化损伤。 3、H2O2可激活食管永生化上皮细胞NF-κB信号通路。 4、TNF-α在体外可激活食管永生化上皮细胞NF-κB信号通路。