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背景与目的:视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，RB)是婴幼儿最常见的眼内恶性肿瘤，恶性程度高，严重危害患者的视力和生命。目前临床上主要的治疗手段包括化疗、放疗、眼球摘除、冷冻治疗和光动力疗法等，但是以上疗法也都不尽人意，随着肿瘤分子生物学的飞速发展，基因治疗将成为一种新型的治疗方式，并显示出广阔的应用前景。Survivin，即生存素或存活素，是1997年发现的凋亡蛋白抑制剂家族成员之一，是迄今为止发现的最强的凋亡蛋白抑制剂家族成员。其在胚胎发育过程中出现，在终末分化成熟的组织中几乎不表达，但很多肿瘤中，如神经母细胞瘤、胃癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌、乳腺癌、白血病等都检测到survivin的表达，因此其被认为是肿瘤的通用抗原。针对survivin的基因治疗具有良好的靶向性、特异性及安全性。Survivin具有抑制细胞凋亡和调节细胞分裂的双重功能，其特异性地表达于细胞周期的G2/M期并能和有丝分裂纺锤体结合，调节细胞有丝分裂。Survivin直接结合并抑制凋亡通路最下游的效应分子caspase-3和caspase-7，因此被称为凋亡通路的“刹车闸”。生存素如果过度表达，细胞失去正常增殖周期中凋亡“开关”的限制，造成细胞增殖增加，凋亡减少，细胞增殖与凋亡的平衡打破，最终导致肿瘤的发生。
靶向survivin的抗肿瘤治疗策略主要有转入显负性突变体、反义核酸、核酶等技术。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是一种抑制特定基因表达的新技术，它通过将双链RNA导入细胞，在Dicer酶的作用下裂解为19～29个核苷酸的小干扰RNA，特异性地降解相应序列地mRNA，导致特定基因转录后沉默。目前RNA干扰已应用于基因敲除、基因表达调控、信号转导和基因治疗等方面的研究，与上述抑制基因表达的研究方法相比，RNA干扰能够更加高效特异地进行特定基因的抑制。
目前国内外相继有学者应用siRNA技术来抑制肿瘤细胞中survivin基因表达的报道，我们查阅了文献但尚未见报道RNA干扰沉默视网膜母细胞瘤中survivin基因表达的研究，故本实验合成了针对survivin基因的RNA干扰双链，观察其沉默视网膜母细胞瘤细胞株SO-RB50中凋亡抑制因子survivin表达的效果，并进一步在细胞学水平上研究survivin对细胞增值和诱导凋亡方面的影响及其可能的作用机制。
方法:首先应用细胞免疫组织化学的方法验证survivin在视网膜母细胞瘤SO-RB50细胞中表达，然后根据人survivin基因的mRNA序列，设计针对survivin基因的siRNA序列和对survivin基因无抑制作用的阴性对照siRNA序列，利用体外化学合成法合成。为了防止绿色荧光FAM标记后影响survivinsiRNA对靶基因的沉默效果，故将FAM标记在阴性对照siRNA的5’末端。首先将FAM标记的阴性对照siRNA与转染试剂以不同的比例转入SO-RB50细胞，分别在转染24h、48h后在荧光显微镜下计数发绿色荧光的细胞占总的细胞的比例，计算转染效率，从而筛选出转染的最佳比例和时间，然后再以最佳比例将survivinsiRNA转入SO-RB50细胞，并设平行对照组。转染24h后通过半定量RT-PCR和WesternBlot检测其对SO-RB50细胞中survivin基因和蛋白表达的抑制作用，流式细胞仪检测转染后细胞凋亡率和细胞周期改变，荧光显微镜下观察细胞凋亡形态。并在转染24h后收集各组蛋白，检测其caspase-3活性。MTT法检测siRNA浓度为10、35、70、100nmol/L时对SO-RB50细胞增殖抑制率。
结果:细胞免疫组化结果显示视网膜母细胞瘤SO-RB50细胞中表达survivin蛋白。具有绿色荧光FAM标记的阴性对照siRNA转染SO-RB50细胞后，结果显示转染成功的SO-RB50瘤细胞有绿色荧光分布。转染24小时和48小时后siRNA(w)与转染试剂topeasy(v)的比例为0.4∶2和0.5∶2时转染效率最高，且在转染比例相同的条件下转染后48小时的转染效率与24小时的相当，故在后续的实验中选择的转染比例为0.4∶2，转染的作用时间为24小时。针对survivin的特异性siRNA转入SO-RB50细胞后能有效地抑制SO-RB50细胞中survivinmRNA和蛋白表达，转染24h后其mRNA表达量较空白对照组减少了(42-68)％，蛋白表达量减少了(54-73)％。流式细胞仪检测发现转染survivin特异性siRNA24h后出现明显的凋亡亚二倍体峰，细胞凋亡率为19.2％，其他处理组未见亚二倍体凋亡峰。细胞周期分析发现survivinsiRNA组细胞被阻滞于G0/G1期，G2/M期细胞比例减少，S期细胞未见明显变化。荧光显微镜下见部分细胞出现染色质浓缩和凋亡小体等典型的凋亡形态学变化。MTT结果显示survivin特异性siRNA浓度为35、70、100nmol/L时对SO-RB50细胞具有增殖抑制作用，100nmol/L浓度的抑制率最高，转染48h后细胞生长抑制率可达42.8％。10nmol/L浓度的survivinsiRNA对SO-RB50细胞生长无抑制作用，阴性对照siRNA对细胞生长也无抑制作用。Caspase-3活性检测显示survivin特异性siRNA组SO-RB50细胞其活性较对照组增加了3.9倍。
结论:体外化学合成的siRNA能有效的转染SO-RB50细胞。RNA干扰技术能明显下调人视网膜母细胞瘤SO-RB50细胞中survivin基因表达，并抑制SO-RB50细胞生长，其机理为下调SO-RB50细胞中survivin的表达，通过激活凋亡通路的终末效应分子caspase-3引起细胞凋亡，并使细胞周期停滞在G0/G1期。针对survivin的RNA干扰技术为视网膜母细胞瘤的基因治疗提供了新的重要途径。