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大米在采后储藏期间极易受曲霉菌(Aspergillus spp.)所侵染,导致大米腐败变质。部分曲霉菌可产生强致癌的次级代谢物黄曲霉毒素B1(AFB1)并残留在大米中,不仅造成粮食浪费和经济损失,还严重危害人们的健康。目前对大米防控常用化学防腐杀菌剂与脱毒剂,但存在化学残留及环境污染等因素而限制其使用种类和应用范围。因此,寻找高效且环境友好的防腐脱毒剂具有重要性与必要性。本文以大米常见的腐败病原菌黄曲霉菌(A.flavus)、赭曲霉菌(A.ochraceus)和AFB1为研究对象,筛选具有优良抗菌活性的植物精油成分(Essential oil components,EOCs)运用于大米储藏中,并进行相关机制探讨,旨在全面分析精油成分对侵染大米腐败菌的防控作用;同时筛选出具有高效去除AFB1能力的微生物,并研究AFB1脱除反应过程、反应前后毒理效应以及生物脱毒转化规律。开展系统的微生物安全性评估,为扩大微生物的推广应用提供保障。最后将精油成分与脱毒微生物联合应用在大米防腐过程中,旨在从源头上控制霉菌并减少或去除已被毒素污染大米中的AFB1,主要研究结果如下:
(1)多种精油成分的体外抗菌活力比较及在大米中的应用研究
前期研究显示许多精油具备抑菌活性,通过比较多种植物精油中普遍存在的组分对腐败菌的抑制活力,确定了两种具有最佳抑菌活性的化合物香叶醇和柠檬醛,其中柠檬醛在体外对黄曲霉和赭曲霉的最低抑菌浓度(MIC)分别为0.5μL/mL和0.4μL/mL。同时将香叶醇和柠檬醛分别用于大米中的试验表明香叶醇和柠檬醛均能显著抑制大米中的微生物数量、延缓MDA含量和脂肪酸值的上升,维持大米淀粉颗粒的完整性,且防腐效果部分优于或接近于商业化学储粮熏蒸剂磷化铝。
(2)香叶醇和柠檬醛分别对黄曲霉和赭曲霉的作用机制及结合气调包装对大米腐败防治的增效应用
从细胞膜通透性、细胞内活性氧变化和霉菌生长相关基因角度分别探讨了香叶醇和柠檬醛对黄曲霉和赭曲霉的作用模式,结果表明香叶醇则分别通过诱导黄曲霉胞内活性氧的产生和改变赭曲霉的膜通透性来显示抗菌作用。柠檬醛主要通过下调黄曲霉的产孢基因brlA及代谢基因laeA的表达量,抑制赭曲霉的生长基因pacC来发挥抑菌特性,并且柠檬醛还可以影响曲霉菌的部分次级代谢产物基因如可以干预调控黄曲霉毒素合成基因aflR和显著降低赭曲霉中编码参与赭曲霉毒素合成的前体酶基因pks、P450-B03的转录水平。结合扫描电镜观察到曲霉菌经过香叶醇处理后其自身微观结构遭到破坏,并伴有细胞内容物溢出,进一步证实香叶醇能显著影响曲霉菌的膜通透性来发挥抑菌防霉作用。同时,柠檬醛和香叶醇分别与50%CO2+50%N2或75%CO2+25%N2气体成分的包装结合对大米的防控效果优于磷化铝熏蒸剂,可起到完全替代磷化铝的作用。
(3)芽胞杆菌对AFB1的去除作用
通过以AFB1类似物的香豆素为唯一碳源培养基进行初筛和高校液相色谱(HPLC)分析复筛获得一株具有去除AFB1能力的新型菌株,经鉴定为阿耶波多氏芽胞杆菌DT,并探究不同反应条件对其清除AFB1的影响,结果表明菌株DT在37℃、pH8反应72h后对2.0μg/mL的AFB1达82.92%清除率。另外,AFB1的毒性评估模型表明AFB1经过阿耶波多氏芽孢杆菌DT处理后对大肠杆菌基本没有毒性作用,且能更好地维持LO2、Caco-2和HaCaT的细胞活力。此外,通过液质联用(HPLC-MS)推测菌株DT与AFB1反应过程中新生成产物的毒性作用减弱是由于原AFB1的内酯结构遭到破坏。
(4)芽胞杆菌菌株安全性评估并分别与柠檬醛和香叶醇联用对大米的防腐脱毒作用
采用不同剂量(108、109和1010CFU/g)的芽胞杆菌DT,一次性灌胃ICR级小鼠并进行15d饲养试验,结果表明不同剂量菌株DT处理的小鼠体重、摄食量、饲料转化率与对照组相比均无明显异常;脏器指数均无显著性差异;组织切片观察小鼠的肝脏、肾脏形态均未发生病变,无明显炎症反应,表明菌株DT在1010CFU/g范围内是实际安全无毒。同时,将菌株DT与柠檬醛和香叶醇共同运用于大米的防治试验中,发现在大米储藏后期,菌株DT与香叶醇共同处理对2.0μg/mL的AFB1去除率为83.88%,其菌落数量为对照组的5%,表明菌株DT与0.5μL/mL的香叶醇不会相互干扰,能共同发挥各自的功效。
综上所述,本文确定了植物精油成分中香叶醇和柠檬醛对黄曲霉和赭曲霉的优良抑制效果,证实了香叶醇和柠檬醛在大米中的防腐作用,并探讨其与腐败病原菌的作用机制。同时筛选获得一株体外去除AFB1的阿耶波多氏芽胞杆菌DT,对其脱毒功效和安全性进行评估,并将其分别与香叶醇和柠檬醛联合运用实现对大米中黄曲霉菌侵染的源头控制且对被AFB1污染的大米进行脱毒的双重防护,为开发新型绿色储粮防霉脱毒剂奠定理论基础,提供实际指导意义。
(1)多种精油成分的体外抗菌活力比较及在大米中的应用研究
前期研究显示许多精油具备抑菌活性,通过比较多种植物精油中普遍存在的组分对腐败菌的抑制活力,确定了两种具有最佳抑菌活性的化合物香叶醇和柠檬醛,其中柠檬醛在体外对黄曲霉和赭曲霉的最低抑菌浓度(MIC)分别为0.5μL/mL和0.4μL/mL。同时将香叶醇和柠檬醛分别用于大米中的试验表明香叶醇和柠檬醛均能显著抑制大米中的微生物数量、延缓MDA含量和脂肪酸值的上升,维持大米淀粉颗粒的完整性,且防腐效果部分优于或接近于商业化学储粮熏蒸剂磷化铝。
(2)香叶醇和柠檬醛分别对黄曲霉和赭曲霉的作用机制及结合气调包装对大米腐败防治的增效应用
从细胞膜通透性、细胞内活性氧变化和霉菌生长相关基因角度分别探讨了香叶醇和柠檬醛对黄曲霉和赭曲霉的作用模式,结果表明香叶醇则分别通过诱导黄曲霉胞内活性氧的产生和改变赭曲霉的膜通透性来显示抗菌作用。柠檬醛主要通过下调黄曲霉的产孢基因brlA及代谢基因laeA的表达量,抑制赭曲霉的生长基因pacC来发挥抑菌特性,并且柠檬醛还可以影响曲霉菌的部分次级代谢产物基因如可以干预调控黄曲霉毒素合成基因aflR和显著降低赭曲霉中编码参与赭曲霉毒素合成的前体酶基因pks、P450-B03的转录水平。结合扫描电镜观察到曲霉菌经过香叶醇处理后其自身微观结构遭到破坏,并伴有细胞内容物溢出,进一步证实香叶醇能显著影响曲霉菌的膜通透性来发挥抑菌防霉作用。同时,柠檬醛和香叶醇分别与50%CO2+50%N2或75%CO2+25%N2气体成分的包装结合对大米的防控效果优于磷化铝熏蒸剂,可起到完全替代磷化铝的作用。
(3)芽胞杆菌对AFB1的去除作用
通过以AFB1类似物的香豆素为唯一碳源培养基进行初筛和高校液相色谱(HPLC)分析复筛获得一株具有去除AFB1能力的新型菌株,经鉴定为阿耶波多氏芽胞杆菌DT,并探究不同反应条件对其清除AFB1的影响,结果表明菌株DT在37℃、pH8反应72h后对2.0μg/mL的AFB1达82.92%清除率。另外,AFB1的毒性评估模型表明AFB1经过阿耶波多氏芽孢杆菌DT处理后对大肠杆菌基本没有毒性作用,且能更好地维持LO2、Caco-2和HaCaT的细胞活力。此外,通过液质联用(HPLC-MS)推测菌株DT与AFB1反应过程中新生成产物的毒性作用减弱是由于原AFB1的内酯结构遭到破坏。
(4)芽胞杆菌菌株安全性评估并分别与柠檬醛和香叶醇联用对大米的防腐脱毒作用
采用不同剂量(108、109和1010CFU/g)的芽胞杆菌DT,一次性灌胃ICR级小鼠并进行15d饲养试验,结果表明不同剂量菌株DT处理的小鼠体重、摄食量、饲料转化率与对照组相比均无明显异常;脏器指数均无显著性差异;组织切片观察小鼠的肝脏、肾脏形态均未发生病变,无明显炎症反应,表明菌株DT在1010CFU/g范围内是实际安全无毒。同时,将菌株DT与柠檬醛和香叶醇共同运用于大米的防治试验中,发现在大米储藏后期,菌株DT与香叶醇共同处理对2.0μg/mL的AFB1去除率为83.88%,其菌落数量为对照组的5%,表明菌株DT与0.5μL/mL的香叶醇不会相互干扰,能共同发挥各自的功效。
综上所述,本文确定了植物精油成分中香叶醇和柠檬醛对黄曲霉和赭曲霉的优良抑制效果,证实了香叶醇和柠檬醛在大米中的防腐作用,并探讨其与腐败病原菌的作用机制。同时筛选获得一株体外去除AFB1的阿耶波多氏芽胞杆菌DT,对其脱毒功效和安全性进行评估,并将其分别与香叶醇和柠檬醛联合运用实现对大米中黄曲霉菌侵染的源头控制且对被AFB1污染的大米进行脱毒的双重防护,为开发新型绿色储粮防霉脱毒剂奠定理论基础,提供实际指导意义。