阿魏酸抗逆菌株的选育及制备纤维丁醇工艺的研究

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丁醇作为一种具有极大潜力的新型生物能源受到广泛关注,联合国国际能源署将丁醇列为第二代生物燃料。生物法制备丁醇可以降低对有限石油资源的消耗和依赖,但是生物法制备丁醇中原料成本占丁醇总生产成本的比例高达60-70%,使其成本过高而制约了它的发展。木质纤维原料在自然界中分布广、含量多且廉价,其分解产物主要含有葡萄糖、木糖等。因此,探索以廉价的木质纤维原料制备燃料丁醇成为生物质能源发展战略的重要组成部分,也是研究的热点之一。  本文首先考察了几种生物质处理方法对玉米芯的水解效果的影响。结果表明稀硫酸高温水解的方法最为经济、合理。然后又研究了稀硫酸处理甘蔗渣和玉米芯水解液的产物成分和浓度。甘蔗渣的糖得率为0.25g/g,低于玉米芯的0.38g/g,但相同浓度糖含量的玉米芯的水解液中可溶性总酚含量明显高于甘蔗渣。综合考虑,选取甘蔗渣作为丁醇生产的原料。处理条件为:物料比1∶5(w/v),2%稀硫酸,125℃,150min。得到的水解液中总糖浓度和可溶性总酚浓度分别为50.1g/L和1.78g/L。  然后,通过常压室温等离子体对出发菌株C.beijerinckii NCIMB8052进行诱变,经阿魏酸,刃天青平板进行初筛,摇瓶发酵复筛,最终得到一株高阿魏酸抗逆性丁醇生产菌株C.beijerinckiiM11。该菌株在30g/L葡萄糖发酵培养基中丁醇和总溶剂产量分别为8.16g/L和11.76g/L,在含有0.8g/L阿魏酸的葡萄糖发酵培养基中丁醇和总溶剂产量分别为6.13g/L和8.92g/L,在未稀释的甘蔗渣水解液培养基中(总还原糖为4.5%)丁醇和总溶剂产量分别为6.36g/L和9.57g/L。相比而言,出发菌株C.beijerinckii NCIMB8052则不能在含有阿魏酸以及水解液的培养基中生长,说明了突变株M11有较强的抗逆性。经多次传代,突变株生长情况和产量稳定,说明了突变株M11具有较好的遗传稳定性。  基于以上研究,将已选育得到的阿魏酸抗逆菌株C.beijerinckii M11作为发酵菌株,利用响应面法优化甘蔗渣酸解糖液制备燃料丁醇的发酵工艺。首先通过Plackett-Burman试验设计从5个因素中筛选出显著影响丁醇生产的3个因素,它们分别是CaCO3、NH4HCO3、ZnSO4·7H2O,然后通过最陡爬坡试验和结果分析逼近极值区域,再根据中心点进行中心组合设计,确定影响因素CaCO3、NH4HCO3、ZnSO4·7H2O的最佳浓度分别为3.14g/L、2.16g/L和0.16g/L。最后经过模拟得出最优条件下丁醇发酵的预测浓度为6.75g/L,验证实验结果为6.68g/L,即实验结果与模拟预测值相吻合。
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