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抗坏血酸(ascorbic acid,AsA),即维生素C,是动物和植物中重要的小分子物质。人类由于缺乏AsA合成中的最后一个酶,不能合成AsA,因此植物是人类摄取AsA的主要来源。植物中AsA除了参与活性氧的清除、光合保护外,还能调控细胞分裂和伸长、开花和衰老等多种生理活动。目前已经阐明植物中主要通过Smirnoff-Wheeler途径合成AsA,除此之外人们也发现了AsA的其他旁路合成途径。
半乳糖内酯脱氢酶(galactono-1,4-lactone dehydrogenase,GalLDE)催化AsA合成的最后一步,将半乳糖内酯脱氢氧化为AsA。植物虽然已经有许多关于GalLDH的研究报道,但也存在许多相互矛盾的结果。此外,由于小麦庞大的基因组和大量重复序列的存在,其功能基因的研究远远落后于模式植物。为了研究AsA在小麦抗逆过程中的的重要功能,并最终将研究结果应用于小麦的改良,我们在小麦中展开TaGalLDH分子遗传和功能的系统研究。
本研究以普通小麦品种小偃54为材料,分离了小麦中TaGalLDH3个成员的cDNA序列和基因组序列,并将3个成员分别定位于5A、5B和5D的长臂上。TaGalLDH的器官表达模式研究表明,TaGalLDH在小麦各个器官呈组成性表达,但在旗叶、幼穗和小穗中的表达量远远高于根、茎、叶中的表达,此外,TaGalLDH的3个成员在不同器官中表达有所差异,预示可能存在的功能分化。通过烟草异源表达TaGalLDH能引起GalLDH酶活性的显著上升,但未伴随AsA含量的增加;在小麦中沉默TaGalLDH显著降低GalLDH的酶活性,同时伴随AsA的下降。离子束诱变的TaGalLDH突变体研究也表明,3个成员的突变体材料GalLDH酶活性和AsA均有显著地下降,并且伴随植株抗氧化能力的降低,但不同成员之间没有显著的表型差异,说明小麦中TaGalLDH参与AsA的合成以及氧化胁迫的抵御,并且不同拷贝对其功能的贡献是大致相同的。此外我们还证明了GalLDH催化合成AsA的过程受到其底物量的限制,并且GalLDH在强光条件下对AsA的积累具有重要的调控作用。在小麦微核心种质材料中,我们发现TaGalLDH的两种单元型变异,这两种单元型变异由于碱基的缺失造成氨基酸的缺失。原核表达单元型变异的GalLDH发现,发生变异的重组蛋白表现出酶活性和底物亲和性的显著降低,说明缺失的氨基酸位点对GalLDH酶活性的重要性。与之相应,存在单元型变异的品种中酶活性显著降低,并且在强光条件下AsA积累受到抑制,这表明TaGalLDH这的单元型变异影响了AsA的合成并可能因此影响强光条件下活性氧的清除。
总之,本论文系统研究了小麦中GalLDH的遗传基础及其在AsA合成和活性氧清除中的作用,并在自然群体中找到一种功能降低的TaGalLDH单元型变异,为进一步研究AsA在小麦光合保护中的功能奠定了理论基础,也为分子育种提供了理论指导。