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骆驼蓬(Peganum harmala Linn)为蒺藜科(zygophyllaceae)骆驼蓬属(Peganurn)多年生草本植物,是我国维吾尔族、哈萨克族和蒙古族等民族沿用已久的民族药,治疗感冒、气喘、疟疾、风湿痹痛等症。现代药理学研究表明骆驼蓬种子中的生物碱类成分具有抗菌、抗炎、抗凝、抗氧化、和抗肿瘤作用,并且具有较强的抑制单胺氧化酶和乙酰胆碱酯酶活性,在治疗阿尔茨海默病(AD)方面有较好的应用开发前景。本文对骆驼蓬总碱提取物的制备工艺进行研究,在对提取物的指纹图谱和化学组成研究的基础上,建立了骆驼蓬总碱提取物的质量标准,并对骆驼蓬总碱提取物的抗AD的作用及其作用机制进行了初步探讨。
以提取物中HAL和HAR为指标,采用正交设计优化了骆驼蓬总碱提取物制备工艺,并通过中试放大生产,获得10批标准提取物。确定的工艺为:取骆驼蓬种子,粉碎后,加入10倍量90％的乙醇浸泡12h后,加热回流提取2h,重复提取3次,将提取液合并后浓缩至流浸膏,加入8倍量2％的盐酸溶液溶解浸膏,离心,过滤得酸水提取液,加适量饱和氢氧化纳溶液调至pH 11,静置24 h后,过滤,干燥沉淀即得。结果所得骆驼蓬总碱提取物HAL和HAR百分含量之和均在50％以上,以上工艺方法重现性好,适合工艺放大生产。
本文对骆驼蓬总碱提取物进行了系统的定性和定量分析评价,建立了科学、适用的质量标准。建立骆驼蓬总碱提取物的特征指纹图谱。色谱条件为:色谱柱:Dikma Diamonsil C18(250mm×4.6mm,5μm);流动相:乙腈:0.1％甲酸(4:96-30:70)梯度洗脱;流速:0.3ml/mim柱温:30℃;进样量:10 μl;检测波长:0-45min,265nm;45-65min,280nm。对10批提取物相似度进行了评价,确定了12个共有峰,结果表明各批次间相似性良好,相似度均在95％以上,平均为98.71％。
采用HPLC-ESI-MS/MS法对骆驼蓬总碱提取物的化学组成进行了研究,根据生物碱的质谱裂解规律,辅以对照品对照,确定了骆驼蓬总碱提取物中10个生物碱类成份,分别为HAL、HAR、鸭嘴花碱3-0-二葡萄糖苷、鸭嘴花碱、鸭嘴花酮碱、路因碱、哈尔醇、8-羟基去氢骆驼蓬碱、哈马酚和四氢哈尔明。研究结果为质量标准制定奠定了基础。
以HAR和HAL为指标,分别采用薄层色谱和高效液相色谱等方法对骆驼蓬总生物碱提取物进行质量控制,制定了骆驼蓬总碱提取物质量标准草案。并对提取物的水分、灰分、浸出物、重金属检查等检查项目进行了研究和测定。确定最佳含测色谱条件为:色谱柱:Agilent Zorbax SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm、);流动相:乙腈-乙酸铵缓冲液(21:79);流速:1ml/min;柱温:35℃:检测波长:330nm;进样量:10μl:理论板数按HAR峰计算应不低于3000。HAL和HAR分别在1.99～1 98.7和0.86～345.3 μg/mg范围内线性关系良好。方法的精密度、稳定性、重复性(RSD均小于2.38％)均良好,HAL和HAR的回收率分别为99.69％和100.66％。通过稳定性研究,确定了提取物的有效期为2年。影响因素试验、加速实验和室温留样实验结果表明,湿度和光照会影响到提取物的稳定性和外观,长期保存时注意防潮避光。
另外,在提取物指纹图谱和化学组成研究的基础上,建立了定量测定提取物中除HAL和HAR外的3个主要微量生物碱如鸭嘴花碱、哈马酚和哈尔醇的含量测定方法。结果发现各批次提取物中这3个生物碱的含量之和均在5％以下,说明各批次提取物中微量生物碱组成和含量较稳定。
通过对骆驼蓬总碱提取物及HAL和HAR的急性毒性进行测定,结果发现小鼠口服骆驼蓬总碱提取物及HAL和HAR的LD50分别为479.1、178.1和414.9 mg/kg。在急性毒性测试的基础上,采用小鼠跳台实验模型考察骆驼蓬总碱提取物及HAL,和HAR对化学性损伤小鼠学习记忆获得、巩固和再现障碍的影响。结果发现骆驼蓬总碱提取物(24 mg/kg)和HAR(10.5 mg/kg)对东莨菪碱所致记忆获得性障碍和30％乙醇所致记忆再生性障碍模型小鼠具有明显的改善作用(P＜0.05),推测提取物中HAR可能为主要活性成份。
在小鼠行为学实验结果的基础上,采用大鼠双侧海马注射Aβ1-40复制痴呆模型,采用Morris水迷宫法考察了骆驼蓬总碱提取物及HAR和HAL对大鼠学习记忆的的改善作用,并在神经生化、相关病理蛋白和基因表达方面的作用机制进行了研究。结果发现,大鼠双侧海马注射Aβ1-40后,学习记忆能力明显下降,寻找平台的潜伏期明显长于空白组(P＜0.05)。骆驼蓬提取物(17、8.5、4.25 mg/kg)、HAL(3.68 mg/kg)和HAR(7.35 mg/kg)与模型组比较发现大鼠寻台潜伏期明显缩短(P＜0.05),且在空间探索实验中穿越原平台区的次数明显增多(P＜0.05)。Elisa法测定结果表明,大鼠双侧海马注射Aβ1-40可造成模型组大鼠皮质中Aβ蛋白含量明细高于空白组(P＜0.01),但对P-Tau蛋白的量无明显影响。与模型组比较发现骆驼蓬提取物和两单体组均可显著性的降低AD模型大鼠皮质中Aβ蛋白的含量(P＜0.01),其中HAL还可以显著性的降低大鼠皮质中P-Tau蛋白的含量(P＜0.01)。采用RT-PCR法测定APP-MPI和APP-KPImRNA蛋白含量,与空白组比较,模型组大鼠皮质中,MPI和KPI mRNA表达均明显升高(P＜0.05),同时海马中KPI mRNA也明显升高(P＜0.05)。骆驼蓬总碱和两单体对APPmRNA的表达无抑制作用,反而对KPI mRNA表达有一定地促进作用(P＜0.05)。推测骆驼蓬总碱提取物可能通过其他途径抑制Aβ蛋白的表达。骆驼蓬总碱提取物和和两个单体对细胞凋亡相关基因mRNA的表达存在双向调节作用,一方面骆驼蓬总碱提取和HAL可以促进细胞凋亡抑制基因Bcl-2 mRNA的表达(P＜0.05),另一方面HAR和HAL又均会上调细胞凋亡诱导基因Bax mRNA的表达(P＜0.05)。在胆碱能系统保护方面,骆驼蓬总碱提取物高剂量组(17mg/kg)大鼠皮质中的AChE活性受到明显地抑制(P＜0.05)。抗氧化应激测定结果表明,单体HAR对模型大鼠皮质中的MDA的产生有明显的抑制作用(P＜0.05)。
综上所述,本研究的提取工艺方法可行性和重现性均较好,适合骆驼蓬总碱提取物的放大生产。所建质量标准科学、可行,可用于骆驼蓬总碱提取物的质量控制。药效学研究表明骆驼蓬总碱提取物可能同时作用于多个病理环节,可以改善注射Aβ1-40痴呆模型大鼠的认知障碍、改善胆碱能系统的功能、抑制Aβ蛋白和P-Tau蛋白的形成。研究结果为骆驼蓬治疗阿尔茨海默病的新药开发奠定了基础。