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研究目的根尖乳头干细胞(stem cells from the apical papilla, SCAPs),位于未发育完成的年轻恒牙的根尖部,是取于正在发育组织的一种成体间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)。SCAPs有多向分化潜能,与牙髓干细胞相比,SCAPs具有更强的增殖与分化潜能,在牙根发育过程中,SCAPs可以分化为成牙本质细胞和形成根部的牙本质,然而,涉及调控SCAPs分化的细胞因子还未阐明清楚。锌指结构同源结构域2 (Zinc fingers and homeoboxes 2, ZHX2)是一种新的转录抑制因子。ZHX2 mRNA在多种组织中广泛表达,有报道显示ZHX2参与调节神经细胞、肝细胞、B细胞和红系细胞等的发育。但是关于ZHX2对牙根发育的作用还不清楚。牙齿的发育形成是由一系列信号分子共同调节,在此过程中,ZHX2是否参与其中呢?在本实验中,我们主要探讨ZHX2对SCAPs增殖及成骨／成牙本质向分化的作用。实验方法与结果1.根尖乳头干细胞的分离,培养及鉴定酶消化法分离培养人根尖乳头干细胞,分别矿化诱导两周和成脂诱导四周,观察SCPAs的成骨和成脂分化潜能,显微镜下观察茜素红和油红0染色,结果显示有大量矿化结节和脂滴的形成；细胞免疫荧光法检测到STRO-1在SCAPs中有明显的高表达；流式细胞仪分析根尖乳头干细胞的表面标记分子,结果显示SCAPs阳性表达CD146和CD24,对上皮细胞源性的CD45则呈阴性表达。2.ZHX2在SCAPs中的内源性表达以及ZHX2与成骨／成牙本质向分化的相关性SCAPs在常规培养基下培养,RT-PCR检测ZHX2在SCAPs中的内源性表达,结果发现SCAPs中有显著的ZHX2的表达；矿化诱导不同时间点,qRT-PCR和Western Blotting共同检测ZHX2与成骨/成牙本质向分化的相关性,结果显示在一定诱导时间段内,ZHX2的表达随矿化时间的延长而升高,提示ZHX2与细胞矿化呈正相关关系,与成骨/成牙本质向分化有密切关联。3.ZHX2对SCAPs增殖及成骨/成牙本质向分化的影响过表达或干扰ZHX2后常规培养细胞,CCK8法检测ZHX2对SCAPs增殖的影响,结果显示ZHX2对SCAPs的增殖有明显抑制作用。过表达ZHX2后矿化诱导一周,qRT-PCR和Western Blotting分别检测牙本质特异性标记物牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein, DSPP)以及成骨相关转录因子(runt-related transcription factor 2, RUNX2)、骨涎蛋白(bonesialoprotein, BSP)、骨钙素(osteocalcin, OCN) mRNA和蛋白水平的表达。结果显示过表达ZHX2后DSPP、RUNX2、BSP、OCN mRNA和蛋白水平均上升。同时,检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)的活性,结果表明ZHX2过表达后SCAPs的ALP活性明显升高。慢病毒干扰ZHX2后矿化诱导3天和5天,检测ALP活性；诱导一周后,qRT-PCR和Western Blotting分别检测矿化相关基因(DSPP、Runx2、BSP、OCN)的表达变化;诱导两周后,茜素红染色观察矿化结节的形成以及进行钙离子的半定量检测。结果显示干扰ZHX2后,ALP活性下降,DSPP、RUNX2、BSP、OCN mRNA和蛋白水平明显降低,与对照组相比矿化结节数量减少,相应的干扰组钙离子含量明显降低。结论SCAPs中存在内源性表达的ZHX2,并且ZHX2的表达水平随细胞矿化时间延长而升高；ZHX2能够抑制SCAPs的增殖；ZHX2对SCAPs成骨/成牙本质向分化起正向调控作用。