肠道菌群在红脂大小蠹攻克寄主油松萜烯防御中的作用

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昆虫的肠道内含有丰富的微生物菌群,它们可以广泛的参与到宿主昆虫特有的生物学和生态学进程中。从更加全面地理解昆虫生活史的角度出发,对这一类群的微生物的研究必不可少。红脂大小蠹(Dendroctonus valens LeConte)是我国的一种重要的入侵性林业害虫。其由北美西部传入,1999年在山西首次发现以后已经致使我国华北及中原地区超过上千万株松树的死亡。红脂大小蠹成功攻克寄主松树的化学防御主要通过两个方面:1)信息素介导的大规模进攻;2)对化学防御物质的解毒和耐受。其中以信息素为基础的化学防治在红脂大小蠹的防控中起到至关重要的作用,但截至目前,其信息素的合成机制,是否有肠道微生物参与其合成等均有待进一步的研究和阐明。另一方面,红脂大小蠹被证明具有耐受寄主防御物质的能力,但是其中是否有肠道微生物参与、如何参与等亦不清楚。本文旨在从这两个方面,分别从肠道微生物物种层面和群落层面去探讨红脂大小蠹肠道微生物如何参与信息素合成和应对寄主松树单萜防御两个方面,从而更好的理解红脂大小蠹成功克服寄主松树化学防御。  红脂大小蠹肠道中含有5种常见的挥发物包括:顺-马鞭草烯醇(Cis-verbenol)、反-马鞭草烯醇(Trans-verbenol)、桃金娘烯醛(Myternal)、桃金娘烯醇(Myternol)、马鞭草烯酮(Verbenone)。其中马鞭草烯酮是一种重要的多功能信息素,在浓度较低时,起到吸引其他小蠹虫的作用;在较高浓度时,起到排斥其他小蠹虫的作用。为了证实肠道菌群是否参与其宿主信息素的合成,我们定性定量的分析抗生素处理组红脂大小蠹的肠道与蛀屑中的化学挥发物并且与非抗生素处理组进行比较。结果显示,顺-马鞭草烯醇在对照组蛀屑中没有被检测到,但是抗生素除菌后的蛀屑中可以被找到,且抗生素处理后红脂大小蠹肠道里的马鞭草烯酮含量受到显著性抑制。该结果说明,肠道微生物参与转换合成马鞭草烯酮,且前体可能为顺-马鞭草烯醇。物种层面,我们对16种肠道细菌进行生测,结果显示其中13种肠道细菌能够在3个不同浓度条件下将顺-马鞭草烯醇转换成马鞭草烯酮,包括:Bacillus aryabhattai、Bacillus sp.、Delftia sp.、Enterococcus faecalis、Herbaspirillum chlorophenolicum、Lactococcus lactis、Pseudomonas sp.1、Pseudomonas sp.5、Pseudomonas sp.6、Pseudomonas sp.11、Rahnella aquatilis、Rhodococcus sp.、Serratia sp.。我们用最低抑菌浓度衡量前体顺-马鞭草烯醇和马鞭草烯酮对肠道细菌的毒性。结果显示,对于16株肠道细菌而言,顺-马鞭草烯醇的毒性显著性强于产物马鞭草烯酮。该结果说明,红脂大小蠹肠道细菌可以帮助小蠹虫合成多功能聚集信息素,且这种合成对其自身而言也是一种解毒。  菌群层面,我们利用454高通量测序,比较了红脂大小蠹雌、雄虫肠道与蛀屑细菌菌群的组成和丰度,并且比较了雌雄虫肠道蛀屑样本粗提物转换顺-马鞭草烯醇为马鞭草烯酮的能力。结果显示:红脂大小蠹雌虫和雄虫肠道细菌群落结构无显著性差异。但是,雌虫蛀屑菌群的OTU序列数、Ace指数、Chao1指数、Shannon指数均显著性高于雄虫蛀屑细菌菌群。雄虫蛀屑样本单独聚类,与雌虫蛀屑样本有显著性差异。进一步的细菌属的水平的丰度比较结果显示:雌虫蛀屑中Lactococcus属、Pseudomonas属等丰富度显著性高于它们在雄虫蛀屑中的丰富度。这两个属的细菌都具有转换顺-马鞭草烯醇到马鞭草烯酮的能力。粗提物实验结果显示,雌虫蛀屑转换合成马鞭草烯酮的能力显著性高于雄虫蛀屑和雌雄虫肠道,进一步验证了前面的分析结果。我们的研究对红脂大小蠹雌雄虫肠道、蛀屑菌群进行了系统比较,且发现雌虫蛀屑在其多功能聚集信息素马鞭草烯酮合成中扮演更重要的角色。  α-蒎烯是寄主松树最主要的防御性单萜化合物,我们以其为研究对象探讨肠道微生物对该防御物质的适应。首先,我们评估了高浓度(6 mg/ml和12 mg/ml)α-蒎烯对红脂大小蠹成虫取食和钻蛀的影响。进一步,在肠道菌物种层面,我们比较了丰度最高的3种肠道细菌(Serratia sp.、Pseudomonas sp.、Rahnellaaquatilis)和3种肠道酵母(Candida piceae、Cyberlindera americana、Candidaoregonensis)对α-蒎烯的耐受能力和降解能力。在肠道菌群落层面,我们分析比较了红脂大小蠹在0 mg/ml,9 mg/mlα-蒎烯条件取食6h和48h后其肠道菌群之间的差异。结果显示,高浓度的α-蒎烯对红脂大小蠹取食钻蛀有显著性的负面效应。物种层面,6种肠道微生物对高浓度α-蒎烯的耐受能力不同且种之间并不一致。三株肠道细菌和两株肠道酵母可以降解20-50%的α-蒎烯。Miseq数据分析结果显示,9 mg/mlα-蒎烯条件下6h的红脂大小蠹肠道菌群β多样性显著性区别于0 mg/mlα-蒎烯6h、0 mg/mlα-蒎烯48 h、9 mg/mlα-蒎烯48 h等3组样品。4组样品之间差异最大的OTU(OTU164789和OTU922761)归属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae),它们在9 mg/mlα-蒎烯条件下6h的红脂大小蠹肠道菌群中含量最高。此外,在所有肠道样本中Sphingomonas和Rhodococcus均具有较高的丰度。以上结果表明,红脂大小蠹肠道微生物具有耐受和降解寄主防御性单萜α-蒎烯的能力,且其肠道细菌菌群可以快速响应高浓度α-蒎烯,最终维持一个稳定的菌群结构以帮助小蠹虫和其自身克服寄主松树的单萜防御。
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