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目的：中枢神经系统损伤与再生修复是当今神经科学研究领域的热点和难点，其中有关神经及其分泌的神经营养因子一直是人们关注的焦点。通过移植胚胎干细胞或外周神经，嗅鞘细胞(OECs)等及其分泌的营养因子来改善神经损伤的微环境，易化受损伤中枢神经再生的潜能，从而达到修复治疗的目的。OECs是近年备受学者关注的可明显促进神经再生的细胞之一，其生物学特性广泛，可表达多种促神经存活和细胞黏附的物质如神经生长因子(NGF)，脑源性神经生长因子(BDNF)，从而发挥其生物学功能。人们通过OECs移植的体内、体外实验证实，OECs能介导受损的神经元的轴突再生出芽，并形成相应的突触联系，从而修复受损的神经系统的功。但是，OECs对缺血缺氧的中枢神经元凋亡的保护作用鲜有报导，OECs及其分泌的细胞因子对大脑皮层神经元缺血缺氧后的作用如何？是否能起到内源性的保护作用及抗凋亡作用?目前该方面研究得还不很深入。NGF，BDNF是否对大脑皮层神经元缺血缺氧损伤有再生修复作用？它们是否通过Ras-MAPK信号传导通路起作用？这些均值得我们进一步研究。本研究的目的是通过体外实验观察OECs，NGF和BDNF对缺血缺氧的皮层神经元的轴突保护及抗凋亡作用，进一步探讨其启动的胞内信号传导通路对中枢神经系统的保护机制。
方法：①从出生24hr的SD(Sprague-Dawley,SD)大鼠的嗅球(Olfactory Bulb，OB)取材进行OECs原代培养。利用差速贴壁方法纯化，清除大部分神经元及其它混杂细胞。低亲和力神经生长因子受体(low affinity growth factor receptor,p75NGR)抗体免疫染色鉴定OECs，待其融合度达70％左右时，制备条件培养基。②从出生24hr内的SD(Sprague-Dawley，SD)大鼠的大脑半球取材进行皮层神经元的原代培养。通过降低血清浓度和加入阿糖胞苷(Ara-C)纯化，清除大部分胶质细胞及其它混杂细胞。MAP-2免疫染色鉴定皮层神经元，培养至第7～8d，制备缺血缺氧模型。③取培养板中生长良好，8d左右的神经元进行OGD培养：吸尽培养液，加入无糖成分的缺氧液(PH=7.35)漂洗，放入密闭容器中，通入5％CO2和95％N2，密闭培养1.5hr后，换为复氧液，继续培养4hr。④体外纯化培养OECs，利用MTT检测细胞活性，免疫组化，RT-PCR，WesternBlotting检测其NGF,BDNF等各种神经营养因子的分泌表达。⑤OECs纯化培养后，待其融合达70％左右时，去除原培养基，加入无血清的培养基，培养24hr收集培养上清，10000 rpm离心15min，取上清，即为OECs条件培养基，添加到生长良好的8d左右的神经元中继续培养。⑥按照差速贴壁法对OECs进行原代培养纯化，纯化好的OECs待其融合达70％左右时，加入胰酶消化重悬后加到生长良好的8d左右的神经元培养板中继续培养。⑦利用MTT，细胞免疫荧光等检测细胞活性及轴突长度，TUNEL染色检测凋亡水平，RT-PCR及Western Blotting检测缺氧前后对OECs及神经元GAP-43，NGF，BDNF及NGFIA的表达。⑧取培养板中生长良好，培养8d左右的神经元按下述随机分组：1)对照组：单纯缺氧培养；2)NGF(50ng/ml)组：在缺氧前30min加入NGF50ng/ml：3)NGF+NGF抗体组：缺氧前1hr加入10umol/L的NGF抗体，30min后加入NGF50ng/ml；4)BDNF(50ng/ml)组：在缺氧前30min加入BDNF50ng/ml：5)BDNF+BDNF抗体组：缺氧前1 hr加入10umol/L的BDNF抗体，30min后加入BDNF50ng/ml；6)NGF+BDNF(50ng/ml)组：在缺氧前30min加入NGF50ng/ml及BDNF50ng/ml，上述各组放入5％CO2、37℃的培养箱中，继续培养24hr后分别经OGD1.5hr，复糖复氧4hr处理。⑨利用Western Blotting检测NGF，BDNF对信号调节通路Ras-MAPK各阶段激酶表达影响。
结果：⑴采用差速贴壁法进行OECs纯化培养，纯度可达90％。⑵OECs生长成一定规律，在培养约9d时达高峰，RT-PCR和Western Blotting显示其表达NGF，BDNF，NT-3，NT-4等多种神经营养因子。⑶OGD处理后，上清组及共培养组存活细胞活性和轴突总长度明显优于对照组(p＜0.01)，而上清组与共培养组比较，后者的保护作用更明显(p＜0.05)。⑷MTT法检测细胞存活率可见对照组神经元的存活率较缺氧前明显下降(48.82±1.76％)(p＜0.01)，经过OECs条件培养基预处理之后，神经元的存活率较对照组分别有所升高(上清组：69.55±2.78％，共培养组：78.13±3.09％)(p＜0.01)。⑸TUNEL显示对照组缺氧后神经元的凋亡率明显升高(51.5±5.68％)(p＜0.05)，经过OECs条件培养基预处理之后，神经元的凋亡率较对照组都有明显减低(上清组：33.12±5.04％，共培养组：25.83±8.64％)(p＜0.05)。⑹RT-PCR结果显示OECs能使经过缺氧处理的细胞GAP-43的mRNA表达上调；缺氧处理能使细胞本身NGF，BDNF表达减弱，复氧后也无变化甚至更弱(模拟缺血缺氧再灌注损伤且无OECs保护)，但OECs能使营养因子表达重新增强，并且刺激NGFIA的表达，说明缺氧刺激OECs分泌表达NGF，BDNF。⑺Western Blotting结果显示OECs能使经过缺氧处理的细胞GAP-43的表达上调(p＜0.001)。其中OECs共培养组较OECs上清组保护作用强(p＜0.05)。⑻添加NGF，BDNF后OGD处理，其存活细胞的活性，轴突总长度，平均树突长度明显优于单纯缺氧组(p＜0.01)，其中NGF保护效果比BDNF好，而同时添加两种因子保护效果并没有累加，添加相应的抑制剂后作用被阻滞。⑼MTT法检测细胞活性可见对照组神经元活性较缺氧前明显下降(0.1964±0.0005)(p＜0.001)，经过NGF，BDNF及两者共预处现缺氧复氧后，神经元的活性较对照组分别有所升高(NGF组：0.4251±0.0047，BDNF组：0.3309±0.0043，NGF+BDNF组：0.2693±0.0024)(p＜0.001)，NGF保护作用最强，BDNF与两者共添加效果相当。⑽TUNEL显示对照组缺氧后神经元的凋亡率明显升高(51.5±5.68％)(p＜0.05)，经过NGF，BDNF及两者共预处理之后，神经元的凋亡率较对照组都有明显减低，(p＜0.05)(NGF组：27.9±3.54％，BDNF组：32.4+2.27％，NGF+BDNF组：30.8±3.11％)。其中又以NGF凋亡率最低(与另外两处理组比较p＜0.05)。⑾Western Blotting结果显示添加NGF，BDNF，NGF+BDNF也出现GAP-43表达上调(p＜0.001)。NGF保护作用最强(p＜0.05)。BDNF与NGF+BDNF效果则相当(p＞0.05)。⑿缺氧本身就可以使ERK1/2表达增加。NGF，BDNF能使神经元急性缺氧胞内Ras-MAPK通路中的ERK1/2，CREB的磷酸化表达增加(p＜0.01)，其中缺氧1～2hr内尤为明显。且能被通路上相对应的抑制剂PD98095和UO126所阻断，同样地阻断高峰在缺氧处理后1～2hr。但不影响胞内总ERK1/2，总CREB的表达。其中NGF的表达还和早期快反应蛋白NGFIA的上调有关。
结论：①OECs可以通过差速贴壁与阿糖胞苷综合方法原代培养获得，利用不同检测方法发现OECs分泌表达NGF，BDNF和NT-3等。②OECs能有效地使缺氧损伤神经元修复，具有抗神经元凋亡作用。其抗凋亡作用可能是通过分泌表达多种营养因子诱导轴突延伸和修复，GAP-43与神经再生有较好的平行相关性。表明OECs具有促进中枢神经系统损伤后修复的巨大潜能。③OGD是能较好地模拟体内急性缺血缺氧的病理模型。利于研究脑梗死的保护因素和功能修复。④NGF，BDNF具有抑制损伤神经元凋亡，诱导神经突起形成，促进神经细胞存活和功能恢复的保护作用。其作用是通过使Ras-MAPK通路中的ERK1/2，CREB的磷酸化表达增加来实现的。提示Ras-MAPK细胞内信号传导通路是NGF，BDNF抗细胞凋亡重要的有效通路之一。⑤NGF，BDNF对神经元的修复保护作用具有时限性，仅对处于凋亡状态的神经元能有效地修复。⑥NGF与BDNF没有明显的协同保护神经元作用，可能是NGF与BDNF有部分共用的Trk家族受体及共同下游通路，同时也与作用细胞的种类，发育程度，受体的表达数目及成分有关。