目的:　　 喉癌是常见的头颈部恶性肿瘤，在全球男性恶性肿瘤中位居第11位，占头颈部恶性肿瘤的35.4％，是中国东北地区最常见的头颈部恶性肿瘤，大约占所有新发恶性肿瘤的1％，近年来喉癌的发病率在世界范围内呈上升趋势[1]。其中95％以上为鳞状细胞癌，发病率有明显的增长趋势。目前，在放化疗和外科手术联合治疗的情况下，Tis、T1及T2期喉癌治疗有效率在80-90％左右，而T3、T4期喉癌只有40-50％[2]。尽管外科手术和放化疗技术有了明显进步，但患者的5年生存率仍没有提高，原因是多方面的，其中对发病机制研究不够完善、没有明确的治疗靶点是最关键的。　　 喉癌的化疗药物以顺铂为主，但缓解率不超过40-70％，完全缓解者尚不足1/5[3]，需要进一步发现并筛选更加有效的生物靶向化疗药物。　　 原癌基因c-src是Bioshop等于1976年发现的第1个细胞癌基因，广泛存在于酵母、果蝇、脊椎动物乃至人类正常细胞中c-src基因具有较强的转化细胞的能力，在调控细胞的生长、发育、分化和其他生物学功能方面具有重要的作用[4-6]。原癌基因c-src的表达产物Src蛋白，是最早发现的Src家族激酶(SFKs)成员，相对分子量大约为60000，是一种非受体酪氨酸蛋白激酶，存在于比较广泛的组织细胞中[7]。Src抑制剂可抑制众多胞内信号转导通路，是细胞存活、增生、游走和黏附的关键调控点，所以Src是一个特别有希望的抗癌分子靶点。　　 Dasatinib是Src家族的激酶抑制剂，是一种Src-ABL双重抑制剂。该药是一种有效的多靶位口服Src抑制剂，可以抑制5种酪氨酸激酶:Src家族激酶、BCR-ABL、C-Kit、Eph受体酪氨酸激酶A2(EphA2)、PDGF2B[8]。研究显示应用Dasatinib可使NSCLCA549及H322细胞株细胞周期停滞于G1-S期，细胞生长减慢，增殖受抑制，并诱导细胞凋亡，阻止肿瘤侵袭和转移[9]。初期临床药物代谢动力学显示实体肿瘤应用Dasatinib治疗后大量Src激活被抑制，且对实体肿瘤患者进行剂量递增的研究显示Dasatinib无剂量限制毒性，耐受性好[10]。　　 本研究首先检测了Src的活化形式磷酸化Src在喉鳞状细胞癌中的表达并探讨其意义，然后研究Dasatinib单独或联合顺铂，对细胞系的体内外抑制作用，并探讨其机理。　　 材料和方法:　　 1、选取中国医科大学附属盛京医院耳鼻咽喉科2008年9月-2010年8月间手术切除的60例喉鳞状细胞癌和30例正常喉黏膜组织，应用免疫组化方法检测P-Src的表达情况。　　 2、用不同浓度的Dasatinib作用于Hep-2细胞不同时间，倒置显微镜观察细胞形态改变，MTT法检测细胞增殖，流式细胞仪检测细胞周期分布和细胞凋亡率，荧光显微镜观察细胞凋亡。Western Blot检测P-Src、Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-8蛋白表达。建立喉癌裸鼠移植瘤模型，观察Dasatinib的体内抑瘤作用。　　 3、Dasatinib、顺铂单独作用或联合作用于Hep-2细胞24、48和36h，MTT法检测计算细胞增殖抑制率，证明两者联合是否有协同作用。流式细胞仪PI单染检测联合用药后细胞周期分布的变化。　　 结果:　　 1、经免疫组化方法检测发现，在喉鳞状细胞癌组织及正常喉黏膜组织中均存在着P-Src的表达，但在喉鳞状细胞癌组织中表达较高，而在正常喉黏膜中则表达较低，差异具有统计学意义。　　 2、MTT实验显示Dasatinib对Hep-2细胞的增殖抑制作用具有明显的剂量-时间依赖性。0.1 mg/ml、1mg/ml和10mg/mlDasatinib作用12h、24h和36h的细胞抑制率分别是17.71±2.78％、26.76±5.44％和38.17±9.86％;26.66±2.06％、47.87±3.22％和58.09±12.62％;57.73±13.69％、72.22±13.44％和86.12±27.17％。经方差分析，各组问均存在显著差异，P＜0.05。表明Dasatinib可诱导Hep-2细胞凋亡，并呈剂量和时间依赖性。经方差分析，具有显著差异，p＜0.01。　　 3、PI单染流式细胞仪检测结果显示Dasatinib导致Hep-2细胞G0/G1期阻滞，同时伴有S/G2M期细胞减少，并具有剂量依赖性和时间依赖性.经方差分析，不同剂量组之间、不同时间组之间及其与对照组之间的差异均有显著性意义，P＜0.05。　　 4、Hoechst33258染色荧光显微镜观察发现，随着Dasatinib浓度增加和作用时间延长，细胞形态发生显著性改变，凋亡细胞明显增多，甚至出现大片细胞脱落形成细胞脱失区。　　 5、Western Blot结果显示Dasatinib可以剂量依赖性抑制Src的激活，激活促凋亡基因Bax、Caspase-3和Caspase-8蛋白表达和抑制抗凋亡基因Bcl-2的蛋白表达。　　 6、体内实验显示50μg/kg/D asatinib治疗组、7.5mg/Kg顺铂治疗组和联合给药组的肿瘤抑制率分别为36.44％、51.27％和62.78％，各组抑制率存在显著差异，P＜0.05。联合治疗组肿瘤抑制率明显大于单药治疗组。　　 7、体外实验显示Dasatinib联合顺铂对Hep-2细胞的增殖抑制效应具有协同作用。　　 结论:　　 1、人喉癌组织及正常喉黏膜组织中表达P-Src，其在喉癌组织中表达较高，而在正常喉黏膜组织中表达较低。　　 2、Dasatinib可以抑制体外培养的喉鳞癌Hep-2细胞和体内裸鼠移植瘤的生长。　　 3、Dasatinib抑制喉鳞癌Hep-2细胞的作用是通过诱导细胞G0/G1期阻滞和凋亡来实现的。　　 4、Dasatinib抑制喉鳞癌Hep-2细胞的作用机理可能是通过抑制Src信号通路的活化，激活促凋亡基因Bax、Caspase-3和Caspase-8表达和抑制抗凋亡基因Bcl-2的表达。　　 5、Dasatinib可通过激活促凋亡基因Bax、Caspase-3和Caspase-8表达和抑制抗凋亡基因Bcl-2的表达来达到抗肿瘤作用，但详细机理有待进一步研究。　　 6、Dasatinib和顺铂协同抑制体外培养的喉鳞癌Hep-2细胞的生长。　　 7、Dasatinib和顺铂抑制喉鳞癌Hep-2细胞的作用是通过诱导细胞从G0/G1期阻滞和凋亡来实现的，联合应用比单药效果好。　　 8、Dasatinib和顺铂联合应用，体内抑制喉癌裸鼠移植瘤的生长作用明显增强。