论文部分内容阅读
口蹄疫（Foot-and-mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth diseasevirus，FMDV)引起偶蹄类动物的一种急性、热性、高度接触性传染病，传播迅速，对畜牧业造成极大的损失。目前，实施捕杀及使用疫苗等传统手段虽然取得了一定的效果，但是仍不能完全有效地控制FMD的发生，因此迫切需要探索新思路，从而找到抵御FMD的新措施。
RNA干扰（RNA interference，RNAi）是由功能性双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）引发的序列特异性转录后同源靶基因沉默现象，是近几年迅速发展起来的一项用于抑制病毒复制的新技术。此外，腺病毒载体因具有感染细胞种类多、感染效率高、外源基因表达水平高且既适于体外又适于体内研究等特点而被广泛用作基因转移载体。
本研究根据我们前期研究获得的含有FMDV特异性siRNA的表达载体pShuttle-VPl和pShuttle-2B，利用PCR方法分别扩增U6启动子和相应siRNA的基因序列，并克隆到pMD19-T simple载体中，构建了质粒pMD-VP1、pMD-2B。通过Pst I/Xho I双酶切后连接，将U6启动子与siRNA-VPI基因同时引入质粒pMD-2B中，成功构建含VPl-2B双基因串联siRNA表达盒的重组质粒pMD-(VP l-2B)。以限制性内切酶PI-Sce UI-CeuI双酶切重组质粒pMD-(VPl-2B)和腺病毒质粒载体pAdeno-X，利用体外连接法获得了重组质粒。经过PCR扩增、酶切鉴定及序列测定，成功构建了重组腺病毒质粒pAd(VPl-2B)，其含有2个串联的FMDV特异性siRNA片段，且每个独立片段前均带有U6启动子基因序列。
用脂质体共转染法，将PacI酶线性化的重组腺病毒质粒载体pAd(VP l-2B)DNA转染HEK293细胞，包装成携带有FMDV VPl、2B双基因串联siRNA片段的重组腺病毒Ad(VPl-2B)，经PCR鉴定正确后增殖、纯化。利用终点稀释法测定病毒滴度为4×1010pfu，mL。对我们前期研究获得的重组腺病毒Advp1、Ad2B进行增殖、纯化及终点稀释法测定滴度，病毒滴度均达1010pfu/mL。
将重组腺病毒Ad(VPl-2B)分别以l、5、10 MOI的量感染IBRS-2细胞，12h后再接种100TCID50 FMDV。病毒滴度检测结果显示，Ad(VPl-2B)能够抑制FMDV在IBRS-2细胞中的复制，而且增加重组腺病毒的量，可增强其对FMDV复制的抑制效果；将不同腺病毒AdvPl、Ad2B、混合Adwl+Ad2B,Ad(VPl-2B)均以10MOI的量感染IBRS-2细胞，12h后再接种FMDV。病毒滴度检测结果显示，重组腺病毒Ad(VPl-2B)介导的RNAi在细胞中抑制FMDV复制作用效果优于AdvPl和Ad2B以及两种重组腺病毒的混合AdvPl+Ad2B感染：以10MOI Ad(VPl-2B)分别在接种FMDV前12h，接种FMDV后Oh、12h、24h，接种FMDV前12h及接种FMDV后Oh这三种条件下感染IBRS-2细胞。病毒RNA拷贝数检测结果显示，接种FMDV前12h及接种FMDV后Oh两次对细胞感染重组腺病毒Ad(VPl-2B)可在48h内100％抑制FMDV复制。说明在细胞水平上以10MOI重组腺病毒Ad(VPI-2B)可最大程度预防和治疗FMDV的感染。
应用豚鼠作为动物模型，评估重组腺病毒Ad(VPl-2B)在动物个体内对FMDV感染的抑制效应。将各组豚鼠（5只/组）分别接种滴度为106、107、l08 PFU的Ad(VPI-2B)，24h后感染100 IDso FMDV。结果发现，l0 PFU Ad(VPl-2B)对保护豚鼠免受FMDV感染的效果最佳；将豚鼠分别接种l0 PFU的AdvPl、Ad2B、混合AdVPI+Ad2B及Ad(VP1-2B)，24h后感染FMDV。结果发现，联合两种含siRNA的重组腺病毒在动物体内对FMDV感染的抑制具有相加效果。研究显示，我们构建的Ad(VPl-2B)在动物水平上对FMDV感染具有较好的保护效果；将豚鼠分别接种108PFU Ad(VP I-2B)后的Oh、24h、48h及72h感染FMDV。结果发现，感染FMDV前24h使用Ad(VP1-2B)对豚鼠的预防保护效果最佳：用10 PFU重组腺病毒Ad(VPl-2B)对豚鼠分别进行单次、两次及三次注射。结果显示，三次注射重组腺病毒Ad(VPI-2B)的保护效果最好，保护率在6天内达到了100％。说明用108 PFU重组腺病毒Ad(VPl-2B)进行预防和治疗能最大程度地增强豚鼠对FMDV的抵抗力。