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目的: 研究胸腺上皮细胞对胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化的各个阶段细胞MHC分子表达的影响，努力寻找一种能降低胚胎干细胞来源的成熟细胞免疫原性的方法，为干细胞移植治疗抗移植排斥策略提供理论和实验依据。 方法: 1.小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的制备:取e13.5天的孕小鼠，用75％酒精消毒后充分剪碎(1-3mm3)，再用0.25％胰酶(Trypsin)-0.02％EDTA溶液消化成细胞悬液，制备成小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。 2.胚胎干细胞(ESC)的扩增:小鼠胚胎干细胞(ESC)接种于经丝裂霉素处理的饲养层MEF上，在含15％胎牛血清、1000IU/ml白血病抑制因子(LIF)、DMEM高糖培养液中培养，每3-4天按1:3-4比例传代扩增一次。 3.ESC向IPC分化诱导: 3.1拟胚体(embryonic bodies，EB)的形成:将培养3-4天的ESC用0.25％胰酶(Trypsin)-0.02％EDTA消化为单细胞后，接种子低粘附性的细菌培养皿，悬浮培养4-5天，使ESC自发分化为EB。 3.2 nestin阳性细胞(nestin positive cells，NPC)的形成:收集培养4-5天的EB，转接于Ⅰ型胶原蛋白包被过的培养瓶，培养24小时，EB贴壁后更换为无血清的DMEM/F12培养液，添加N2、纤维连接蛋白、bFGF。连续诱导培养2-3天可形成NPC。 3.3胰岛素分泌细胞(insulin-producing cells，IPC)的形成:NPC形成后，更换为含肝细胞生长因子、活化素-A、β-细胞素、烟酰胺、bFGF和不含血清的DMEM/F12的IPC诱导培养液，继续诱导培养，至第4天，培养液中添加10mmol/L浓度的葡萄糖，24小时后更换为含葡萄糖20mmol/L的新鲜诱导培养基继续培养至IPC形成并聚集为胰岛样细胞团（islet-like cell clusters，ICCs）。 4.小鼠胸腺上皮细胞的分离: (1)酶消化法:无菌取小鼠胸腺，充分剪碎(1-3mm3)，加0.25％胰蛋白酶消化液，37℃水浴，离心，弃上清，加0.2％胶原酶，37℃水浴，弃上清，用比重为1.077的细胞分离液分离，取第二条条带接种于细胞培养瓶中培养，24小时后，第一次换液，以后每3天换一次液。细胞经HE染色和免疫组化染色鉴定。 (2)组织快法:取小鼠胸腺组织，剪碎，直接放入培养瓶中培养，加适量培养液培养，3天后换液，待上皮细胞爬满瓶后，可传代冻存。细胞经HE染色和免疫组化染色鉴定。 5.小鼠胸腺细胞上清的制各:无菌取胸腺组织，剪碎，酶消化，中和离心后，直接将细胞以1×106/ml接种到培养瓶。8小时后收集瓶中悬浮细胞（去除贴壁的上皮细胞和成纤维细胞），离心后将细胞重悬，以1×106/ml细胞密度加入无血清DMEM培养（排除血清中未知因子对实验的干扰），培养24小时收集细胞悬液，离心后去细胞，取上清液保存备用。 6.胸腺上皮细胞与EB共培养及ES向IPC定向分化的诱导:ESC培养3-4天后，转接于用胸腺上皮细胞包被过的培养瓶，诱导培养至ICC形成。 7.共培养各阶段免疫原性检测:与胸腺上皮细胞共培养的EB、NPC、IPC和ICC，用MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ抗体处理后流式细胞仪(FCM)分析，检测MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ分子表达情况。 8.胸腺细胞培养上清液对EB向IPC分化及MHC表达的影响:ESC培养3-4天后，等量接入用Ⅰ型胶原蛋白包被过的培养瓶，培养瓶分三组，分别加入20％、40％和60％的胸腺细胞上清液，诱导至ICC形成。 9.条件培养液培养细胞各阶段免疫原性检测:添加胸腺细胞上清的条件培养液培养的EB、NPC、IPC和ICC，用MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ抗体处理后流式细胞仪(FCM)分析，检测MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ分子表达情况。 结果: 1.本实验能获得增殖能力旺盛及纯化的MEF饲养层。采用MEF和LIF相结合的方法培养ESC，ESC扩增能力强，能长时间维持干细胞特性。 2.实验采用分阶段诱导方法，在胸腺上皮细胞共培养的条件下，ESC也可以正常诱导分化为胰岛样细胞团。 3.在胸腺上皮细胞分离时，采用酶消化法在细胞培养4天后可见少量上皮细胞。组织块法培养一周左右，组织块周围爬出大量上皮细胞。织块法比酶消化法方便简单，通过长时间培养能获取更多的胸腺上皮细胞。 4.经HE染色和免疫组化染色，胸腺上皮细胞细胞形态不一，呈三角或多角形，彼此紧密相接呈铺砖样排列，免疫组化CK8蛋白着色的阳性部位位于胞质区。 5.EB与胸腺上皮细胞或不同浓度的胸腺细胞上清共培养后，随着分化的不同阶段，MHC-1和MHC-Ⅱ分子表达都逐渐降低。 结论: 1.EB与胸腺上皮细胞共培养不影响EB向胰岛样细胞团分化。 2.在与胸腺上皮细胞共培养中，和对照组相比，MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ分子表达在EB、NPC阶段较高，无统计学意义，在IPC、ICC阶段MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ分子表达比对照组低，统计学有意义，故认为，胸腺上皮细胞在ESC向胰岛样细胞团分化共培养中能降低分化细胞的免疫原性。 3.胸腺细胞培养上清液中存在能抑制MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ分子表达的因素。