小分子RNA(microRNA)是真核生物内源性表达的一类非编码的大小为22-25个核苷酸的RNA，它主要通过抑制蛋白翻译或降解mRNA来使基因表达沉默。人工小分子RNA(Artificial microRNA，amiRNA)是利用天然小分子RNA骨架，例如mircroRNA30，经过人工加工后表达出的人为设计的小分子RNA。人工小分子RNA通过与mRNA靶标完全匹配，从而使其降解，达到类似RNA干扰的作用。这种人工小RNA与传统的小分子发卡状RNA(small hairpin RNA，shRNA)相比具有更高的表达量和基因沉默效率。现有的人工小RNA设计方法主要根据以往的经验，具有很大的局限性，而通过筛选覆盖整个靶基因序列的人工小分子RNA文库可以弥补这方面的不足。由于酶学方法具有方便和经济的特点，因而开发一种酶学方法来构建人工小分子RNA文库具有非常实用的价值。这种方法还可以很经济的构建针对整个转录组的人工小分子RNA文库，从而实现转录组水平的RNA干扰筛选。当然，随着小分子RNA功能研究的逐步深入，人工小分子RNA可能具有更加广阔的应用前景。　　 用酶学方法构建shRNA干扰文库已有报道，其主要步骤包括，较短双链cDNA的获得，含MmeI酶切位点的茎环状衔接子的连接，MmeI酶切形成均一大小的shRNA，第二衔接子的连接，发卡结构的打开并与载体连接，酶切去掉环状结构的多余序列后形成最终的文库。用酶学方法构建人工小分子RNA文库尚未见报道，由于小分子RNA具有较为复杂的前体结构使其更具挑战性。　　 我们利用酶法构建了人工小分子RNA文库。在构建过程中，我们参考了shRNA文库构建方法并进行了以下创新：1.我们以RNA作为起始材料，通过随机引物反转录和第二链合成得到双链cDNA，这样形成的双链cDNA其反义链5端为平末端，而另一端大多是粘末端,这样就可以解决构建文库中序列取向性的问题。2.采用反转录的方法具有另外一个优点，就是可以将反转录时随机引物的5末端两个碱基设定为A或T，这样表达出来的人工小分子RNA其反义链5末端具有较低的热力学稳定性，有利于其进入RISC复合体从而发挥沉默效应。3.在打开发卡结构时引入了基因组学研究方法中的锁铐探针(Padlock probe)的方法使第二衔接子环化，这样就能够利用链置换能力和保真性最强的Phi29 DNA聚合酶通过滚环扩增(Roiling cycle ampiification，RCA)来打开发卡结构并扩增，从而保证了茎环结构和序列的准确性。　　 我们首先构建了针对小鼠p53基因的人工小分子RNA文库，以证实这种酶学方法的可行性。通过对文库中82个人工小分子RNA克隆进行筛选，我们得到了7个对p53基因有较强沉默效果的人工小分子RNA并对其功能进行了验证。为证明这种方法也可用于构建针对整个转录组的人工小分子RNA文库，我们用小鼠胚胎cDNA文库体外转录出的RNA为起始材料，构建了针对小鼠胚胎整个转录组的人工小分子RNA文库。结果显示，文库中含有表达与各种不同转录子的互补的人工小分子RNA的克隆。　　 通过本项研究，我们建立了一种可用来构建人工小分子RNA文库的酶学方法，然后以此构建了针对小鼠p53基因的人工小分子RNA文库，并对其进行了筛选和功能验证。我们进一步的研究表明这种方法还可以应用于构建针对整个转录组的人工小分子RNA文库。