鸡传染性喉气管炎(ILT)是由鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)引起鸡的一种急性、高度接触性上呼吸道传染病,呈全球性流行,是危害养禽业的重要疫病之一。目前国内外防制本病普遍采用弱毒疫苗。这些疫苗的毒力普遍偏强,可以在鸡体内潜伏感染,而且在鸡体传代过程中毒力返强。因此,研制更安全而有效的疫苗,将有利于彻底控制乃至根除ILT。自从1990年出现基因免疫以来,许多病毒的不同基因导入各种动物体内,产生了很好的免疫效果。DNA疫苗作为第3代疫苗,因其既有亚单位疫苗的安全性,又有减毒活疫苗的有效性而受到研究人员的瞩目。但是DNA疫苗诱导机体产生的抗体水平低,还不能完全有效抵抗致死剂量病原体的攻击。怎样增强免疫保护效果显得尤为紧迫。许多研究已经表明,细胞因子具有明显的免疫增强作用,包括IL-2、IFN-γ、IL-6、IL-18等。本研究根据已发表的ILTV SA2疫苗株gB基因序列(M64927)设计、合成了1对引物,以ILTV CG株基因组DNA为模板扩增gB基因,并进行克隆和测序。根据真核表达载体pcDNA3.1(+)和ILTV gB全基因核苷酸序列,设计、合成1对引物,PCR扩增ILTV gB全基因。将EcoRⅠ和XhoⅠ酶切获得的gB基因片段克隆到经同样处理的真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/gB。根据pGEM-ChIL-18设计1对引物,上、下游引物分别加入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点,扩增IL-18全基因核苷酸序列,将该基因片段重组到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/IL-18。为测定构建的编码ILTV糖蛋白gB基因的重组DNA疫苗与鸡IL-18联合免疫的试验效果,将pcDNA3.1/gB、pcDNA3.1/IL-18分别或联合免疫21日龄SPF雏鸡,两周后加强免疫。首免后每周抽取外周血及外周抗凝血,应用ELISA和流式细胞仪分别检测免疫鸡的体液免疫及细胞免疫水平。二免疫后第3周用100ELD50 ILTV强毒进行攻击。结果显示,pcDNA3.1/gB和pcDNA3.1/gB与pcDNA3.1/IL-18联合免疫组均能诱导鸡产生特异性的体液免疫及细胞免疫应答,其中以pcDNA3.1/gB与pcDNA3.1/IL-18联合免疫组的T淋巴细胞亚群CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+明显高于单独pcDNA3.1/gB免疫组(P<0.01),87%抵抗ILTV强毒的致死性攻击。本试验采用的真核双表达载体plRES,是双顺反子结构,具有两个多克隆位点。将鸡传染性喉气管炎病毒( ILTV)的gB基因和鸡白介素18( IL-18)基因分别或同时插入双顺反子质粒pIRES中,在启动子下游的MCS A的酶切位点Xho I与Mlu I之间插入鸡传染性喉气管炎病毒gB基因片段,在MCS B的酶切位点Sal I与Not I之间插入鸡白介素-18基因片段,获得表达ILTV gB基因的pIRES/gB质粒、表达鸡白介素-18基因的pIRES/ IL-18质粒及共表达质粒pIRES/gB/IL18。