目的：　　 1.本课题组已完成化学萃取方法制备去细胞周围神经修复材料的标准技术流程研究，并在鼠、猴的动物模型修复神经缺损获得较好疗效，但着眼于临床应用，同种异体材料的来源受到包括伦理学因素在内的多种因素制约，考虑开发异种同类型材料的替代应是理想选择。在做替代材料研发之前，必须对人体材料本身的成分结构变化和物理力学性能变化进行观察研究，以便后期的对比。　　 2.目前国内外尚无去细胞神经修复材料应用于临床的生物安全标准。而生物安全的可靠性是临床应用的前提，根据相关文献和规定研究确定其生物安全标准的检测方法和检测指标，并获国家权威机构的认可是为必要前提。故本课题组与中国药品生物制品检定所首先共同研究制定标准，并按此标准进行人体去细胞材料的多种生物安全性研究与检测，观察其是否达到临床应用所要求的生物安全标准。　　 3.综合本研究目的叙述前2项的考虑，以人体材料作为异种材料，以家兔为受体来进行多项生物安全性研究和检测，观察作为异种材料移植修复后受体的生物安全性，为临床使用异种材料替代提供依据。　　 4.本课题组使用自体骨髓基质干细胞作为种子细胞构建的组织工程化神经修复神经缺损，已在鼠、猴的动物模型取得较好效果，但临床如果个体化的使用自体细胞作为种子细胞，存在诸多不便和不可操作因素。使用同种异体之细胞并形成细胞库可能是解决的途径，而且可标准化有利于产业化。使用异体干细胞作为种子细胞的主要障碍在于其可能存在的免疫排斥和异体细胞是否可在受体的移植物内发挥同样或类似的对再生神经轴突生物学效能。本研究以猕猴为模型来进行观察研究，并设计使用对陈旧性损伤修复后的神经再生观察和电生理观察来比较。　　 材料与方法：　　 1、材料：　　 1.1人体材料：来自于本院创伤严重、肢体毁损、截肢的残肢内的新鲜神经干，经剥离周围结缔组织并修剪而成，用于结构成分分析者，修剪成40-50mm节短备用，用于物理性状与力学研究者修成直径分别为1.5mm和5mm的长2cm的节段备用。　　 1.2实验动物：　　 猕猴，体重2.5-5.0 KG，雌雄各半，来自广东蓝岛生物技术有限公司|。　　 新西兰大白兔、小鼠、豚鼠均来自北京中国药品生物制品检定所动物中心，数量与组别详见后述内容；　　 1.3猕猴同种异体去细胞神经材料和自体异体骨髓基质干细胞来自于上述猕猴；　　 2、方法：　　 2.1人体去细胞神经材料结构成份分析：HE；SABC免疫组化(含S-100，NF，COL-1，LN)髓鞘及其半定量分析。　　 2.2.生物力学研究；使用中检所提供的万能材料试验机测定去细胞神经的断裂强度、断裂力、断裂伸长率。　　 2.3生物安全标准制定：以ISO10993标准生物材料安全性检测方法为基准，和中检所的老师共同选定体外细胞毒性、溶血、全身急性毒性、热源、皮肤刺激、致敏、遗传毒性为标准方法，其正常生物安全值为指标。　　 2.4异种材料移植：以去细胞人体周围神经材料为供体，新西兰大白兔为受体并被制成神经缺损修复模型，其自体神经移植和未去细胞的人体新鲜神经移植修复为对照，以植入体内后不同时段(1w，2w，4w)外周血血清内IgG、IgM的含量(ELISA法)和植入体及其周围肌肉组织的HE形态学表现(细胞浸润的类型和程度)为指标，研究评估宿主对异种材料植入的免疫反应状态和移植物本身的免疫原性；　　 2.5制备猕猴桡神经2cm缺损模型，同种异体去细胞神经材料与自体和异体骨髓基质干细胞分别构建含不同种子细胞的组织工程化神经，连同单纯去细胞材料和自体神经移植修复组共4组，每组2个动物但处理双侧，取外周血用ELISA法分别在术后3d，1w，2w，4w检测血清中IFN-γ，IL-4含量，并在术后2个月取移植体本身和两端神经组织行免疫组化观察，以CD3+，CD68+，CD163+T细胞的浸润为指标；　　 2.6将上述(2.5)的动物在原植入的神经移植材料作为标本取出后，又制备成3cm缺损的陈旧性桡神经缺损模型，再次重复上述的修复(组别与对照设计一样)。但此次是于术后5个月首先进行神经电生理检测观察神经再生的指标，然后再次取出移植体作为检测标本，分别做HE形态学，免疫组化和透射电镜观察，以评估神经再生状况。　　 结果：　　 1、按本课题组制定的标准技术流程制备的去细胞人周围神经支架材料与新鲜的人周围神经相比较，S-100、NF及髓鞘的含量有显著性差异(P＜0.05)，而COL-1、LN差异不大(P＞0.05)；　　 2、按本课题组制定的标准技术流程制备的去细胞人周围神经支架材料，不同的直径其断裂力和缝合力无明显差异(P＞0.05)，但最大应力差异显著(P＜0.05)；　　 3、按本课题组制定的标准技术流程制备的去细胞人周围神经支架材料体外细胞毒性为1级；体外溶血率为2.6％；全身急性毒性阴性；热源实验体温的变化范围为-0.2至0.4℃，每只动物温度升高均小于0.6℃；皮肤刺激实验无反应；致敏刺激指数为0；Ames试验中，支架材料浸提液的各个浓度下无论是加入活化系统S-9还是不加，回变菌落数均未大于自然回变菌落的2倍；微核试验中小鼠骨髓内微核细胞数与阴性组没有显著性差异；符合临床应用的生物安全标准，达到中国药品生物制品检定所的国家要求，已获临床应用的生物安全许可。　　 4、异种移植后，新鲜未处理神经周围组织细胞浸润的数量较去细胞人周围神经支架多，持续时间明显延长；植入后1～4周，其血清中IgG明显高于去细胞神经材料组和自体神经组(P＜0.05)，去细胞神经材料组和自体神经组没有明显差异，在观察时间内，IgM各组没有明显差异(P＞0.05)；移植后6周，去细胞人神经支架材料和自体移植神经内有新生血管形成，新鲜未处理神经内未发现有新生血管形成：　　 5、猕猴自体或者异体BMSCs与同种异体去细胞周围神经支架体外复合构建的组织工程化神经材料一期修复猕猴周围神经损伤后，异体BMSCs组与自体BMSCs组组间同时间段比较血清IFN-γ与IL-4水平均无显著差异(P＞0.05)；2M时免疫组化研究发现四组均有相同程度的CD3+细胞浸润，而单纯支架组的CD68+、CD163+细胞的数量明显低于其他三组(P＜0.05)；单纯支架组的S-100、NF的数量也明显少于其他三组(P＜0.05)；　　 6、猕猴自体或异体BMSCs与同种异体去细胞周围神经支架体外构建的组织工程化神经，二期修复猕猴周围神经损伤后5M，两组再生神经的形态上稍有差异，但轴突计数没有显著性差异(P＞0.05)，神经电生理检测显示自体细胞移植组和异体细胞移植组神经复合动作电位的的最短潜伏期、峰值、神经传导速度组间差异无统计学意义(P＞0.05)。　　 结论：　　 1、按本课题组制定的标准技术流程制备的去细胞人周围神经支架材料，其标准结构、成分和物理力学性能为：能够完全去除内部的细胞、髓鞘、轴突等物质，同时保留了细胞外基质、基底膜的胶原、层粘连蛋白等有效成分，并仍然呈现中空、多孔的复杂空间结构；其抗张力强度有所下降，但不影响无张力缝合修复；　　 2、基于ISO10993标准生物材料安全性检测实验方法、FDA、欧盟CE认证，以及中检所制定的其他生物材料的生物安全性国家检测方法，确定体外细胞毒性，溶血，全身急性毒性，热源，皮肤刺激，致敏，遗传毒性为标准方法，其正常生物安全值为指标，并获中国药品生物制品检定所认可。按本课题组制定的标准技术流程制备的去细胞人周围神经支架材料，无细胞及遗传毒性，不引起溶血、全身急性反应，不致宿主发热、致敏和皮肤刺激，生物相容性好；植入动物体内后，不引起明显的局部刺激反应和全身免疫反应，是安全的生物材料，已经通过中国药品生物制品检定所的生物安全性评估，可供同种异体移植临床试用，同时具有异种移植的可能性；　　 3、使用去细胞人体神经材料作为异种移植材料，兔作为宿主的研究中，提示未去细胞的新鲜神经材料有明显的免疫排斥，六周内未发现血管化迹象，但去细胞神经材料未发现有明显的免疫排斥，早期就有血管化迹象，与自体神经移植类似；　　 4、使用同种异体骨髓基质干细胞作为种子细胞复合构建的组织工程化神经材料，在猕猴神经缺损修复动物模型中，没有证据显示宿主出现免疫抑制或免疫排斥现象，宿主免疫应答状态与自体神经移植或自体干细胞作为种子细胞的移植材料时的免疫应答状态无明显差异；　　 5、负载有自体或同种异体BMSCs的猕猴组织工程化人工神经修复陈旧性周围神经缺损的动物模型观察中，术后5个月，其再生神经轴突计数未见明显差异，其提示再生现象的神经电生理指标检测也未见明显差异。提示同种异体或自体干细胞作为种子细胞可能可以相互替代。