论文部分内容阅读
目的:采用慢性不可预测性温和应激(CUMS)诱导小鼠抑郁模型,运用转录组学和代谢组学整合策略,研究中药刺五加(ASH)对CUMS模型小鼠大脑前额叶皮层内基因表达和代谢物的的影响。通过研究差异共表达基因的生物信息和代谢物参与的生物代谢通路,并结合胰岛素抵抗和炎症反应相关指标,阐明ASH治疗抑郁症作用机制。方法:(1)首先进行糖水偏好测试筛选实验用雄性ICR小鼠,随后按照体重和糖水偏好率将小鼠分为正常组(N,n=10)、模型组(M,n=10)、ASH三个药物干预组(HD,400 mg/kg,n=10;MD,200 mg/kg,n=11;LD,100mg/kg,n=10)和阳性药氟西汀组(PD,10 mg/kg,n=10)。实验期间,每周记录小鼠的体重和摄食量。CUMS造模进行6周后,进行行为学评估、葡萄糖耐受性测试(OGTT)以及血清炎症因子和胰岛素检测,从药效学的角度初步考查ASH对CUMS模型小鼠的干预作用。(2)运用RNA-seq转录组学技术对N组、M组、ASH最佳剂量(MD)组前额叶皮层基因进行差异表达分析。对筛选后的差异表达基因,分别进行GO、KEGG和蛋白互作网络等生物信息学注释分析。(3)通过GC-MS代谢组学技术检测小鼠前额叶皮层代谢物,采用多维统计方法分析M组与其他5组小鼠前额叶皮层的差异性物质,搜索NIST 05数据库、HMDB和KEGG数据库获得差异代谢物的信息,结合Metaboanalyst 4.0在线综合分析平台,获得代谢通路。结果:(1)与N组小鼠相比,从第4周开始,M组小鼠的体重和摄食量开始显著降低(P<0.05);在第6周的糖水偏好实验中,M组小鼠表现出降低的糖水偏好(P<0.05)。随后,在强迫游泳和悬尾实验中,M组小鼠的静止不动时间增加(P<0.05,P<0.001),在敞箱实验中,M组小鼠的行为学得分降低(P<0.01)表明M组小鼠出现抑郁样行为。在高架十字迷宫中,M组小鼠进入开放臂的频率和开放臂所待时间百分比均减少(P<0.05),出现焦虑症状。血清生化指标检测结果表明:M组小鼠出现高空腹胰岛素水平(P<0.01)、肿瘤坏血因子-α和白介素-6水平(P<0.05)。药效学研究结果表明,ASH各剂量组显著增加由CUMS诱导的体重降低、摄食量减少,并且改善CUMS模型小鼠的抑郁和焦虑样行为、胰岛素抵抗和炎症反应。其中刺五加中剂量疗效较好,较稳定。(2)RNA-seq测序结果表明,CUMS造模改变了部分基因的表达水平,而ASH干预逆转了其中14个基因的表达(P<0.05,且Fold Change(FC)值>1.2或<0.83)。这14基因参与生物学过程(BP),如:细胞内过程类别、单个组织过程类别和生物调控类别;构成细胞组成部分(CC),如:细胞相关组分类别和细胞器组分;具有绑定分子类别和催化活性类别的分子功能(MF)。KEGG通路富集分析结果表明:能量相关的代谢通路如:甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解、β-丙氨酸代谢和磷酸戊糖途径被显著富集。进一步的研究发现:少突胶质细胞特异性蛋白基因(Opalin)和血红蛋白相关基因(Hba-a1,Hbb-bs和Alas2)在应激诱导的抑郁症中起重要作用;Retsat和Plin4基因表达异常与CUMS引起的胰岛素抵抗现象密切相关;而Hibch和Etnppl基因的表达异常可能会诱导CUMS模型小鼠出现代谢紊乱。(3)代谢组学研究中通过多维统计分析发现N组与M组小鼠在前额叶皮层中存在代谢差异。随后通过OPLS-DA分析,筛选并鉴定出24个代谢物(VIP>1,且P<0.05)。这些代谢物主要参与(a)氨酰t RNA生物合成,(b)丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,(c)甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢,(d)柠檬酸循环(TCA循环),(e)缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成,(f)泛酸盐和辅酶A生物合成和(g)泛醌和其他萜类醌生物合成,这7条代谢通路。刺五加HD组、MD组和LD组分别逆转了11种、13种、15种差异代谢物的变化。热图聚类分析结果表明MD组对上述24个差异代谢物的改善效果最接近阳性药-氟西汀。氟西汀逆转了14个代谢物的变化,其中,L-天冬氨酸参与的丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代谢是阳性药特异性改善通路。结论:(1)ASH具有抗抑郁作用,其作用机制与改善CUMS小鼠的胰岛素抵抗现象和抗炎症反应密切相关。(2)RNA-seq转录组学分析表明ASH可以改善由CUMS诱导的应激小鼠前额叶皮层基因表达异常。其中少突胶质细胞特异性蛋白基因(Opalin)、血红蛋白的合成(Hba-a1,Hbb-bs和Alas2),胰岛素抵抗(Retsat和Plin4)和大脑前额叶皮层代谢紊乱(Hibch和Etnppl)相关基因可能参与抑郁症的发展。(3)代谢组学分析结果表明与N组相比,M组小鼠前额叶皮层中确实出现了代谢紊乱,而ASH可以改善由CUMS诱导的小鼠前额叶皮层代谢异常。