本文包括三部分:第一部分：棘阿米巴生物学特性的研究 目的：观察研究棘阿米巴生物学特性。 方法：纯化培养棘阿米巴，光学显微镜下和倒置显微镜下观察其形态结构；MTT法检测不同温度及不同酸碱度对棘阿米巴活力的影响。做棘阿米巴在不同pH值条件下的生长曲线。比较甲醇及戊二醛两种固定方法对棘阿米巴特殊染色的差异。 结果：棘阿米巴有滋养体、包囊两个阶段，并有滋-包过渡时期，典型的二分裂方式进行增殖，分裂时，核仁与核膜消失，细长的“分裂丝”可见。二分裂的两个棘阿米巴之间有可能具有一定的内在联系。 棘阿米巴对酸碱环境具有很强的耐受性，在pH值为3～10，温度-40℃～35℃条件下(除温度-40℃、pH3外)均可存活。温度(4℃～35℃)时，棘阿米巴在偏酸性的环境中多以滋养体形式存在，相反，在偏碱性的环境中，棘阿米巴则多以囊前期或包囊状态存在。温度不适宜时(-80℃～-20℃)，偏酸性的环境中的棘阿米巴多皱缩，甚至破裂、呈多量碎屑；相反偏碱性环境中，棘阿米巴多仍能以规则的囊前期或包囊状态存在。pH6.5为棘阿米巴生长最适pH值。 甲醇固定可使棘阿米巴滋养体“圆化”和“出囊”，而戊二醛固定可较好地保持棘阿米巴滋养体形态。不同的染色方法棘阿米巴形态有所差别。 结论：棘阿米巴为一种生物学特性较为复杂的自生生活原虫，二分裂的两个棘阿米巴之间可能存在一定的内在信息联系。偏酸性的环境中，棘阿米巴多以滋养体形式存在；相反，偏碱性的环境则使棘阿米巴多以包囊形式存在。与甲醇固定方法相比，戊二醛固定方法能更好地保持棘阿米巴滋养体的状态。 第二部分：棘阿米巴对角膜细胞损伤作用的实验研究 目的：观察棘阿米巴滋养体、包囊及棘阿米巴对数生长期培养上清液与人角膜上皮细胞、角膜基质细胞的共培养过程。分析棘阿米巴培养液与对数生长期培养上清液蛋白谱差异。 方法：建立体外培养人角膜上皮细胞、人角膜基质细胞系，以呈浓度梯度的棘阿米巴滋养体与角膜细胞作用，不同时间点观察玻片面上残存的细胞百分比，比较两种细胞系对棘阿米巴滋养体敏感性的差异。以棘阿米巴滋养体致角膜细胞损伤的最适浓度分别与人角膜上皮细胞、角膜基质细胞作用，不同时间点取片，分别进行姬姆萨染色光镜下观察和戊二醛固定后扫描电镜观察。同上方法，观察棘阿米巴对数生长期培养上清液与角膜细胞共培养过程的变化。棘阿米巴包囊与角膜细胞共培养，观察共培养过程中的变化，并定量计数棘阿米巴包囊、滋养体及滋养体所占百分比随时间点变化。新鲜配置棘阿米巴培养液，离心收集棘阿米巴对数生长期培养上清液，两样本均进行SDS-PAGE电泳，电泳胶带分别采用考马斯亮蓝和硝酸银染色观察分析。 结果：两种角膜细胞系对棘阿米巴滋养体敏感性有所不同。较低浓度(104/ml)的棘阿米巴滋养体即可引起角膜基质细胞的损伤，而要引起角膜上皮细胞的损伤，则需要更高的滋养体浓度(105/ml)。在106/ml的棘阿米巴滋养体作用下，两种细胞系均可产生明显的损伤。 依据上述实验结果，选择106/ml作为棘阿米巴滋养体引起角膜细胞损伤的最适浓度。取片姬姆萨染色光镜下观察可见：在与角膜上皮细胞作用过程中，棘阿米巴首先进入角膜上皮细胞的缝隙连接处，以此作为进入点，引起细胞的固缩、细胞间缝隙的加宽，在与角膜基质细胞作用时，则早期出现在细胞之间的空白区域。在后续的过程中，两种细胞系与棘阿米巴滋养体作用呈现相似的改变：角膜细胞胞浆溶解、胞核肿胀甚至碎裂，同时可见棘阿米巴在培养细胞表面的分裂像。24小时后，覆盖玻片表面的完整的细胞单层完全被破坏，棘阿米巴呈极度的伸展及分裂状态。 扫描电镜观察可见：与角膜上皮细胞作用时，棘阿米巴伸出细长的“伪足”至角膜上皮细胞紧密的缝隙连接处，呈潜掘性进展，同时引起细胞的皱缩、细胞间缝隙加宽。角膜基质细胞呈无序排列，在棘阿米巴与其作用过程中，未见到类似的现象。两种细胞与棘阿米巴作用的过程中，均可看到棘阿米巴伸向细胞表面的细长“棘刺”、“食杯(foodcup)”、特征性“舌足”以及多个棘阿米巴成串相连的现象。 棘阿米巴对数生长期培养上清液对两种细胞损伤作用基本一致，共培养9小时可见细胞固缩，24小时后，可见25％左右的单层细胞被破坏。 106/ml的棘阿米巴包囊与角膜细胞共培养，2.5～3小时后，棘阿米巴包囊(近100％)开始向滋养体形态转化，并逐渐增多，24小时后几乎全为滋养体状态。 SDS-PAGE电泳结果显示：棘阿米巴培养液与对数生长期棘阿米巴培养上清液电泳条带在考马斯亮蓝染色条件下，仅见一条共同的位于66.2kDa左右的条带；而在硝酸银染色条件下，两条带则呈现明显的差异。 结论：棘阿米巴与角膜细胞作用时，接触性细胞损伤与非接触性细胞损伤同时存在，共同起作用。 人角膜上皮细胞间具有紧密而有序的缝隙连接，因而与角膜基质细胞相比，具有更强的抵抗棘阿米巴接触性损伤的能力。而非接触性细胞损伤对两细胞系基本相同。因此，角膜上皮细胞在阻止棘阿米巴入侵的过程中起着十分重要的作用。 棘阿米巴包囊作为棘阿米巴原虫的静止状态，与角膜细胞共培养，可迅速地向滋养体状态转化。 培养液中棘阿米巴的存在引起蛋白谱的变化，而这有可能造成了非接触性细胞损伤作用。 第三部分：棘阿米巴性角膜炎临床分析 目的：棘阿米巴性角膜炎临床分析。 方法：对1991年5月至2006年2月在北京市眼科研究所确诊的121例棘阿米巴性角膜炎患者的一般情况、危险因素、实验室检查、来源地区进行回顾性分析；并对其中有完整病历资料的32例棘阿米巴性角膜炎患者的危险因素、临床表现、实验室检查、治疗及预后进行回顾性分析。 结果：91～94年共有患者9例，95～98年共有患者20例，99～02年共有患者49例，03～06年2月共有患者42例。121例患者中，农民59例，学生32例。危险因素中包括配戴角膜接触镜17例、配戴角膜塑形镜19例，角膜创伤40例，异物进入眼中20例。实验室检查：角膜刮片细胞学检查和棘阿米巴培养阳性率分别为82％(99/121)和74％(90/121)。患者来源地已遍及12个省、自治区及2个直辖市。有完整病历资料32例，其中学生13例，农民15例。危险因素中包括配戴角膜接触镜14例和角膜创伤13例。主要的临床表现为角膜溃疡、弥漫性基质浸润和环形溃疡。角膜刮片细胞学检查和棘阿米巴培养阳性率分别为94％(30/32)和66％(21/32)，其中4位患者在共焦显微镜检查下察见包囊。治疗主要采用0.02％洗必泰，0.5％新霉素，0.4％甲硝唑滴眼液联合治疗，同时结合1％洗必泰局部烧灼和角膜清创或角膜板层切除术。平均疗程为80天(18～150天)。27例患者溃疡愈合，形成角膜云翳或白斑，其中12只眼的最好矫正视力≥0.2。 结论：棘阿米巴性角膜炎患者数量呈上升趋势，其早期诊断至关重要，联合应用抗棘阿米巴药物、局部清创术或角膜板层切除术、和烧灼术为眼内科目前治疗的最佳选择。