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大豆苷元(Daidzein)是大豆异黄酮类植物雌激素的一种,流行病学及动物饲养试验结果表明,摄入大豆苷元在人体中可以降低心血管疾病、骨质疏松症、乳腺癌、前列腺癌等疾病发病率;在畜牧生产中能够促进动物的生长,提高其繁殖性能,提高肉、蛋、奶等畜产品的产量,改善畜产品的品质;但大豆苷元调节脂类代谢的机制尚未被阐明。大豆苷元可以被肠道细菌转化为活性更高的代谢产物雌马酚,为阐明大豆苷元及其代谢产物雌马酚对大鼠脂类代谢的影响,本论文首先通过体外厌氧培养确定了一株雌马酚产生菌zx7的代谢及耐受特性,并根据国家标准确定了使用该菌株进行动物在体试验的安全性。随后,以去卵巢SD大鼠及假手术大鼠为模型动物,通过直接灌胃方式给药,比较大豆苷元、雌马酚及雌马酚产生菌zx7对SD大鼠采食量、体增重、子宫重量及体脂成分的影响,并比较了反映大鼠脂类代谢水平的血清脂类组成、激素含量及肝脏脂类成分和脂代谢关键酶活性,以及肝脏中脂类代谢相关转录因子和关键酶编码基因的表达情况,最后比较了大鼠粪样中雌马酚含量、菌群结构和主要细菌数量的差异,以研究肠道微生物在大豆苷元调节脂代谢过程中的作用。
1.菌株zx7的代谢特性、耐受特性及急性毒性研究通过体外厌氧培养了解菌株zx7以大豆苷元为底物产生雌马酚及其他代谢产物的情况;通过调节培养基pH值及添加胆盐模拟消化道化学环境以确定菌株zx7耐酸耐胆盐能力;根据中华人民共和国国家标准(急性毒性试验,GB15193.3-2003)设计试验,通过霍恩氏(Horn)法经口灌胃评估菌株zx7的急性毒理特性。结果显示:菌株zx7在体外厌氧条件下能够将大豆苷元转化为雌马酚,同时产生氨和挥发性脂肪酸(主要是乙酸);菌株zx7在pH值1.5或3mg/mL胆盐浓度下可以存活30min以上;菌株zx7毒性级别为无毒,最大耐受量MTD>215mg/Kg BW。
2.大豆苷元、雌马酚及大豆苷元+雌马酚产生菌zX7对不同内源雌激素水平大鼠采食量、体增重和体脂成分的影响使用平均体重为211±9g的卵巢摘除和假手术雌性Sprague-Dawley大鼠各30只,以直接灌胃方式给药,比较大豆苷元、雌马酚及雌马酚产生菌zx7对SD大鼠采食量、体增重、子宫重量及体脂成分的影响。结果显示:卵巢摘除手术对SD大鼠日平均采食量无明显影响,大豆苷元可以显著降低卵巢摘除大鼠的采食;卵巢摘除大鼠体增重极显著高于假手术大鼠,给予大豆苷元和雌马酚处理可以降低卵巢摘除大鼠体增重,雌马酚显著降低了假手术大鼠的体增重;卵巢摘除手术造成SD大鼠子宫重量极显著降低,大豆苷元和雌马酚对SD大鼠子宫重量无显著影响;卵巢摘除手术和异黄酮处理未对SD大鼠腹脂重量造成显著影响;灌胃大豆苷元、雌马酚和大豆苷元+雌马酚产生菌zx7的SD大鼠臀大肌肌肉脂肪含量与对照组相比无显著差异(P>0.05);大豆苷元、雌马酚及大豆苷元+雌马酚产生菌zx7在卵巢摘除大鼠中趋于提高臀大肌不饱和脂肪酸比例,而在假手术大鼠中趋于提高饱和脂肪酸比例,但差异均未达到统计显著(P>0.05)。
3.大豆苷元、雌马酚及大豆苷元+雌马酚产生菌zx7对不同内源雌激素水平大鼠血液指标和肝脏脂类代谢的影晌对上述卵巢摘除和假手术雌性大鼠的血清和肝脏样品进行脂代谢相关指标分析,以比较大豆苷元、雌马酚及大豆苷元+雌马酚产生菌zx7对SD大鼠血清脂类组成、激素含量及肝脏脂类成分和脂代谢关键酶活性的影响。结果显示:大豆苷元和雌马酚可以降低SD大鼠血清中脂类物质,尤其是胆固醇的含量;大豆苷元和雌马酚的血脂调节作用与瘦素和胰岛素相关,主要通过抑制SD大鼠肝脏内脂类物质合成,促进脂类物质分解实现;在对SD大鼠血液和肝脏的脂类代谢调节作用上,雌马酚较其前体大豆苷元表现出更高的生物活性;雌马酚产生菌zx7可以提高大豆苷元在调节SD大鼠血脂及肝脏脂质水平中的积极作用。
4.大豆苷元、雌马酚及大豆苷元+雌马酚产生菌zx7对不同内源雌激素水平大鼠肝脏脂类代谢相关基因表达的影响应用实时定量PCR技术比较分析大豆苷元、雌马酚及大豆苷元+雌马酚产生菌zx7对上述卵巢摘除和假手术雌性SD大鼠肝脏中雌激素受体(Estrogen Receptorα/β,ERα/β)、过氧化物酶体增殖物激活受体α(Peroxisomal proliferator activated receptorα,PPARα)、固醇调节原件结合蛋白2(Sterol regulatory element binding protein2,SREBP2)、脂肪酸合酶(Fatty Acid Synthase,FAS)、激素敏感酯酶(Hormone SensitiveLipase, HSL)、β-羟基-β-甲基戊二酸单酰CoA还原酶(3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Coenzyme A reductase,HMGCR)、低密度脂蛋白受体(Low-Density Lipoprotein Receptor, LDLr)及胆固醇7α-羟化酶(Cholesterol7α-hydroxylase,CYP7A1)的编码基因表达的影响,以了解大豆苷元、雌马酚及大豆苷元+雌马酚产生菌zx7影响SD大鼠脂类代谢的可能机制。结果表明:卵巢摘除显著提高了SD大鼠肝脏中雌激素受体的基础表达量;大豆苷元、雌马酚和大豆苷元+雌马酚产生菌zx7处理极显著提高了假手术大鼠肝脏中ERβ的相对表达量;SD大鼠肝脏PPARαt的相对表达量被大豆苷元上调,被雌马酚下调,两者差异极显著;大豆苷元、雌马酚或大豆苷元+雌马酚产生菌zx7均极显著下调假手术大鼠肝脏中的SREBP2相对表达;大豆苷元、雌马酚或大豆苷元+雌马酚产生菌zx7均极显著下调卵巢摘除大鼠肝脏中FAS、HSL、HMGCR、LDLr及CYP7A1的相对表达量,在假手术大鼠中被调节的方向和幅度上存在显著差异。
5.大豆苷元、雌马酚及大豆苷元+雌马酚产生菌zx7对不同内源雌激素水平大鼠粪样中雌马酚含量、菌群结构和主要细菌数量的影响应用HPLC技术、PCR/DGGE技术和实时定量PCR技术比较大豆苷元、雌马酚及大豆苷元+雌马酚产生菌zx7对上述卵巢摘除和假手术雌性SD大鼠粪样中雌马酚含量、菌群结构和主要细菌数量的影响。结果表明SD大鼠肠道中存在能够转化大豆苷元生成雌马酚的细菌,通过灌胃外源雌马酚产生菌zx7可以改变SD大鼠雌马酚产生能力,SD大鼠内源雌激素水平对肠道微生物组成具有显著影响,SD大鼠肠道内拟杆菌门细菌数量与粪样中雌马酚水平呈极显著正相关关系。