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目的:
(1)探讨TLR4在牙龈卟啉单胞菌感染血管内皮细胞引起炎症反应过程中的介导作用。
(2)观察牙龈卟啉单胞菌和变形链球菌对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化形成的影响,初步探讨其影响动脉粥样硬化的炎性反应机制。
方法:
(1)牙龈卟啉单胞菌分别感染正常EAhy926细胞和TLR4基因敲减的EAhy926细胞(简称T4—1细胞)后,用RT—PCR的方法观察两种细胞在受到细菌感染后IL-6 mRNA和IL-8 mRNA的表达水平;用ELISA的方法检测两种细胞IL-6和IL-8的蛋白表达水平;用荧光标记法观察两种细胞在牙龈卟啉单胞菌感染后黏附单核细胞的能力。
(2)以ApoE-/-小鼠作为受试对象,经尾静脉注射的方式感染牙龈卟啉单胞菌和变形链球菌,连续注射14周。用ELISA方法检测小鼠血清中炎性因子IL-6、TNF—α的表达量;用石蜡切片进行苏木素-伊红染色的方法分析斑块大小;用免疫组化染色的方法分析TLR2、TLR4、MCP—1、VCAM-1、ICAM-1在斑块局部的表达量。
结果:
(1)EAhy926细胞受到牙龈卟啉单胞菌作用后,炎性细胞因子IL-6和IL-8mRNA及细胞浆中的蛋白表达水平在短时间内显著升高(P<0.05),随着作用时间的延长,细胞活性受到抑制,IL-6和IL-8 mRNA和蛋白的表达水平呈下降趋势。T4—1细胞被牙龈卟啉单胞菌刺激后,IL-6和IL-8 mRNA和蛋白的表达水平与EAhy926细胞具有相似的变化趋势,但T4-1细胞IL-6和IL-8mRNA和蛋白的表达水平显著低于EAhy926细胞(P<0.05)。
(2)EAhy926细胞对单核细胞的黏附作用随着牙龈卟啉单胞菌作用时间的延长而增强,T4—1细胞在受到牙龈卟啉单胞菌刺激后,黏附单核细胞的功能具有和EAhy926细胞相似的变化趋势,但T4—1细胞黏附单核细胞的功能明显低于EAhy926细胞(P<0.05)。
(3)牙龈卟啉单胞菌或变形链球菌感染ApoE-/-小鼠后,小鼠主动脉粥样斑块面积与无感染对照组小鼠相比明显增大(P<0.05),且钙化坏死严重,多为晚期斑块。免疫组化结果显示:感染细菌的小鼠在粥样斑块局部TLR2、TLR4、MCP-1、VCAM-1和ICAM-1的阳性表达率比未感染细菌的小鼠显著升高(P<0.05),血清中IL-6、TNF—α的表达量也显著升高(P<0.05)。同时感染两个细菌的小鼠比单独感染牙龈卟啉单胞菌或变形链球菌的小鼠上述炎性因子表达量显著升高(P<0.05)。
结论:
(1)TLR4能够介导牙龈卟啉单胞菌感染EAhy926细胞的炎性反应。
(2)牙龈卟啉单胞菌或/和变形链球菌的感染能加速ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的形成,促进斑块局部的炎性反应。