自噬是细胞本身通过溶酶体降解途径来清除细胞质中蛋白大分子和细胞器的一种在进化上高度保守的现象。细胞在代谢应激条件下,细胞能够通过自噬清除异常代谢物质,避免细胞病变、损伤以及变性的发生,因此,自噬在促进细胞存活中发挥重要作用。镉是一种具有高毒性的工业和环境污染物,能够对人和动物的健康造成损伤。近年来研究表明,镉能够通过血脑屏障进入脑组织,影响神经系统的正常功能。临床研究发现,镉能够造成神经行为缺陷,是导致儿童认知障碍和神经退行性疾病发生的重要原因。体外研究表明,神经细胞自噬在镉引起的毒性损伤中具有保护作用。最新研究表明,神经元衰老是导致神经退行性疾病的重要原因之一。但是镉对神经细胞衰老影响以及自噬在神经细胞衰老中的作用尚不明确。本研究拟采用PC12细胞和大鼠大脑皮质神经元(原代神经细胞)作为模型,通过体外实验探讨镉诱导神经细胞自噬发生的机制,研究自噬在镉致神经细胞衰老中的作用及调控机制,为揭示镉致神经细胞毒性机理提供科学依据。1.镉对神经细胞衰老的影响为了研究镉对神经细胞衰老的影响,本实验选用PC12细胞作为模型。用RTCA实时检测技术监测不同浓度醋酸镉(0、2.5、5、10 μmol/L)处理条件下PC12细胞的生长曲线,结果表明,与对照组细胞相比,10 μmol/LCd组细胞的细胞指数(CI)明显下降。在一定的浓度和时间范围内,呈现明显的剂量依赖和时间依赖效应,说明镉对PC12细胞具有明显的毒性作用;选用PC12细胞和原代神经细胞作为模型,不同浓度醋酸镉(0、5、10、20μmol/L)分别处理PC12细胞和原代神经细胞24h后,统计PC12细胞β-半乳糖苷酶阳性细胞的数量;qRT-PCR法检测镉对原代神经细胞炎性因子ILlα、IL6基因表达的影响;蛋白免疫印迹法检测PC12细胞衰老相关蛋白P53、P21、P16的表达;10 μmol/L醋酸镉处理PC12细胞不同时间(0、2、4、6、8、12、24 h),蛋白免疫印迹法检测PC12细胞衰老相关蛋白的表达;10 μmol/L醋酸镉处理PC12细胞或原代神经细胞24 h,通过对F-actin染色,观察镉对PC12细胞及原代神经细胞骨架的影响;结果表明,与对照组相比,10μmol/L醋酸镉处理PC12细胞24 h能够极显著增加表达β-半乳糖苷酶阳性细胞的数量(P<0.01);PC12细胞或原代神经细胞内F-actin结构受到明显的损伤;PC12细胞P53、P21和P16衰老相关蛋白的表达显著性升高(P<0.01)呈时间和剂量依赖关系;随着镉浓度的升高,原代神经细胞炎性因子IL1α、IL6基因的表达量逐渐升高呈剂量依赖关系(P<0.01)。提示镉能促进神经细胞衰老。2.自噬在镉诱导神经细胞衰老中的作用为了探讨自噬在镉诱导神经细胞衰老中的作用,本研究采用自噬激活剂100 nmol/L雷帕霉素(RAP)预处理PC12细胞或原代神经细胞24 h,用醋酸镉处理24 h,统计β-半乳糖苷酶阳性细胞的数量,结果显示,与单独染镉组相比,RAP与镉联合处理组PC12细胞中β-半乳糖苷酶阳性细胞的数量极显著减少(P<0.01)。免疫印迹法检测PC12细胞中P53、P21和P16相关蛋白的表达,与镉单独处理组相比,RAP与镉共处理组P53、P21和P16衰老相关蛋白的表达水平极显著性降低(P<0.01);RT-PCR法检测原代神经细胞IL1α、IL6基因的表达,结果显示,RAP能够抑制镉引起的IL1α、IL6基因的表达(P<0.01)。通过采用自噬的抑制剂CQ或3-MA预处理PC12细胞0.5 h,或采用Atg5 siRNA干扰技术抑制自噬,然后镉处理细胞6h,通过采用RTCA技术测定细胞细胞生长曲线,与镉单独处理6 h组相比,添加CQ后能够明显降低PC12细胞指数;免疫印迹结果显示,与镉单独处理组相比,添加3-MA或转染Atg5 siRNA均能够促进衰老相关蛋白表达的增加。综上说明自噬在镉诱导的神经细胞衰老中具有抑制作用。3.内质网应激在镉诱导神经细胞自噬中的作用为探讨内质网应激在镉诱导神经细胞自噬中的作用,本研究选用PC12细胞和原代神经细胞作为模型,10μmol/L醋酸镉分别处理PC12细胞和原代神经细胞不同时间(0、2、4、6、8、12、24 h),免疫印迹法检测内质网应激相关蛋白Bip、ATF4、CHOP、p-eIF2α的表达。结果显示,10 μmol/L醋酸镉处理两种细胞不同时间后,PC12细胞中CHOP蛋白随着时间的延长,表达量逐渐升高,其余蛋白的表达在6 h达到最高,然后逐渐降低。内质网应激抑制剂mithramycin与醋酸镉单独或联合培养PC12细胞和原代神经细胞6 h,免疫印迹法检测Bip、LC3蛋白表达;通过间接免疫荧光染色,观察Bip蛋白的表达及分布;将稳定转染有EGFP-RFP-LC3B基因的PC12细胞按照上述方法处理后,激光共聚焦观察LC3聚点。结果表明,Mithramycin不但显著抑制了镉诱导的Bip蛋白的表达,同时还能明显降低LC3-Ⅱ的表达水平(P<0.01)及LC3聚点。说明镉能够诱导神经细胞内质网应激的发生,内质网应激在镉诱导神经细胞自噬中起到正调控作用。4.Bip/AMPK在镉诱导神经细胞自噬与衰老中的作用为进一步说明内质网应激分子伴侣Bip在镉诱导神经细胞自噬与衰老中的作用,用Bip siRNA转染PC12细胞抑制Bip基因表达,10μmol/L醋酸镉分别处理阴性干扰(NC)组和Bip干扰(siBip)组细胞不同时间(0、2、6、24h),试剂盒法检测并统计β-半乳糖苷酶阳性细胞的数量;免疫印迹法检测相关蛋白Bip、LC3、P21的表达。结果显示,与NC组相比,镉处理siBip组6 h后β-半乳糖苷酶阳性细胞的数量极显著增加(P<0.01);Bip、P-AMPK和LC3-Ⅱ蛋白表达量明显下降,P21蛋白表达量明显升高。镉处理NC组Bip干扰siBip组细胞6 h或镉与Bip抑制剂BAPTA单独或联合作用细胞6 h,激光共聚焦显微镜观察细胞内EGFP-RFP-LC3的表达及分布。结果显示,与NC组细胞相比,镉处理siBip细胞6h后,LC3黄色聚点明显减少;与镉单独处理组相比,BAPTA与镉联合处理组细胞LC3黄色聚点明显减少。为了探究Bip在镉激活AMPK/mTOR通路中的作用,不同浓度醋酸镉(0、5、10、20μmol/L)处理PC12细胞或原代神经细胞6h,结果表明,随着镉浓度的升高,P-AMPK表达量逐渐升高,呈剂量依赖关系;镉与BAPTA单独或联合作用PC12细胞或原代神经细胞6 h,免疫印迹检测P-AMPK表达,结果显示,与镉单独处理组细胞相比,BAPTA与镉联合处理组细胞AMPK磷酸化水平极显著性降低(P<0.01)。镉处理NC细胞和siBip细胞6h,免疫印迹检测P-AMPK、P-AKT、P-S6K蛋白表达,与NC组细胞相比,镉处理siBip组细胞P-AMPK蛋白表达水平降低,P-AKT、P-S6K蛋白表达水平升高。综上说明Bip在镉诱导的神经细胞自噬与衰老以及在镉激活AMPK通路中具有调节作用。5.ROS在镉诱导原代神经细胞自噬和衰老中的作用为了揭示ROS在神经细胞自噬和衰老中的作用,本研究选用PC12细胞和原代神经细胞为模型,10 μmol/L镉和ROS抑制剂100 nmol/LNAC单独或联合处理PC12细胞或原代神经细胞6h或24h,结果显示,与镉单独处理组相比,NAC与镉联合处理6h,PC12细胞中LC3Ⅱ蛋白的表达无明显变化;20 μmol/L镉和100 nmol/LNAC单独或联合处理原代神经细胞6h免疫印迹检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Atg5、Atg7表达(P<0.01)。为说明ROS在镉诱导神经细胞衰老中的作用,NAC与镉联合处理细胞24 h,与镉单独处理组相比,PC12细胞P21蛋白表达量降低,呈极显著性差异(P<0.01),β-半乳糖苷酶阳性细胞的数量极显著性减少(P<0.01),原代神经细胞IL1α、IL6基因表达水平极显著性降低(P<0.01)。综上说明,不同浓度的镉在不同时间对神经细胞自噬和衰老的影响不同,ROS在镉诱导神经细胞自噬与衰老的过程中发挥重要作用。