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铅污染已成为全球公共卫生问题之一。铅是一种广泛持久存在于环境中的污染物,它可以对各种生物体产生危害。由于神经系统是铅的主要靶器官,因此铅引起的健康危害一直备受关注。但是,铅神经毒作用机制迄今仍未很明确。已有研究报道铅致神经毒性可能与细胞的氧化应激有关。为此,本研究主要围绕抗氧化功能调控的核因子E2相关因子2 (nuclear factor erythroid 2-related factor, Nrf2)/血红素加氧酶1(heme oxygenase 1, HO-1)通路开展了相关研究,旨在揭示此通路在抵御铅致神经毒性中的分子机制,为铅致神经系统损害的防御新策略提供科学依据。第一部分：Nrf2在铅致神经毒性中的保护作用研究目的：探讨Nrf2转录因子在铅致神经毒性中的作用。方法：用设定浓度的醋酸铅(lead acetate, PbAc)处理SH-SY5Y细胞,用CCK-8法检测细胞存活率、DCHF荧光探针法检测胞内ROS水平、Annexin V FITC-PI法检测细胞凋亡率,Western Blot法检测细胞核中Nrf2的含量以及HO-1和γ谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-glutamylcysteine synthetase, γ-GCS)的含量,q-RT-PCR法检测Hmox1、谷胱甘肽转移酶αl(glutathione S-transferase alpha 1, GSTαl)、谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚基(glutamate-cysteine ligase catalytic subunit, GCLC)、谷氨酰半胱氨酸连接酶调节亚基(glutamate-cysteine ligase, regulatory subunit, GCLM)和苯醌氧化还原酶(NAD(P)H:quinoneoxidoreductase, NQO1)的mRNA水平。用小RNA干扰(small interfering RNA, siRNA)技术敲降细胞中Nrf2后,检测上述基因的mRNA水平和蛋白表达水平。用乙酰半胱氨酸(acetyl-L-cysteine, NAC)和二苯基碘酰氯(diphenyliodonium chloride, DPI)处理细胞后,检测细胞存活率。PbAc处理经转染pCMV-Nrf2过表达Nrf2的细胞,检测细胞存活率、胞内ROS水平、细胞凋亡率和Bax、Bcl2、CytoC、pro-Caspase3的蛋白水平。结果：PbAc主要诱导了细胞的氧化应激介导的神经毒作用；NAC和DPI具有抗氧化作用并能显著抑制PbAc的细胞毒性。PbAc可激活转录因子Nrf2转位入核与抗氧化反应元件(antioxidant response element, ARE)区域结合,并能启动下游基因的表达。PbAc激活了基因Hmox1、Gsta1、Gclc、Gclm和Nqol的转录,同时伴有HO-1和γ-GCS蛋白表达的上调。当敲降Nrf2基因则显著抑制上述基因的转录和表达。过表达Nrf2可抑制PbAc诱导的活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)积累和细胞凋亡,提高细胞存活率。结论：Nrf2-ARE系统在铅致神经凋亡中具有保护作用。第二部分：HO-1在铅致神经毒性中的保护作用研究目的：探讨HO-1转录因子在铅致神经毒性中的作用。方法：用PbAc分别处理大鼠原代海马神经细胞和SH-SY5Y细胞后,检测HO-1的蛋白水平和mRNA水平。用PbAc处理SH-SY5Y细胞后,检测P38、ERK1/2、 JNK、STAT3和PI3K/AKT信号通路的变化。用上述通路特异性抑制剂处理后,检测HO-1的蛋白水平。过表达或敲降细胞HO-1后,检测细胞存活率、胞内ROS水平、细胞凋亡率和Bax、Bc12、Bcl-x1的蛋白表达水平。结果：PbAc分别处理大鼠原代海马神经细胞和SH-SY5Y细胞后,胞内ROS水平升高,细胞凋亡率增高,PbAc诱导HO-1在mRNA和蛋白水平的表达。进一步研究显示,PbAc激活了ROS依赖性P38、ERK1/2和PI3K/AKT信号通路,以及ROS非依赖性JNK信号通路,促进了HO-1的表达。当细胞内过表达HO-1时,可显著降低铅致ROS积累和细胞凋亡。但是,敲降HO-1后则促使细胞内ROS产生和细胞凋亡。结论:HO-1能有效抑制铅诱导的氧化应激和细胞凋亡而产生保护作用。第三部分：t-BHQ激活Nrf2/HO-1通路抑制铅神经毒性目的：探讨Nrf2/HO-1在铅致神经毒性中的作用。方法：用Nrf2的激活剂特丁基对苯二酚(tertiary butylhydroquinone, t-BHQ)和PbAc联合处理发育期SD大鼠后,检测海马和皮层中丙二醛(methane dicarboxylic aldehyde, MDA)水平、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和还原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)活性：用Nissl染色检测大鼠海马神经元的变性死亡和存活情况并检测了Nrf2蛋白含量和Nrf2-ARE结合力。用t-BHQ、放线菌酮(cyclohexane, CHX)或放线菌素D (actinomycin D, Act.D)先处理SH-SY5Y细胞后,再用PbAc染毒后,检测Nrf2或HO-1的mRNA和蛋白表达水平。分别敲降细胞Nrf2和HO-1后,检测细胞存活率、胞内ROS水平、Caspase 3/7酶活力以及Bax和Bc12蛋白的表达水平。结果：整体动物实验显示,在发育期大鼠脑组织的海马和皮层中,t-BHQ降低了MDA水平,诱导了超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和GSH活性,显著地改善了PbAc诱导的氧化应激。而且,t-BHQ抑制了PbAc所致的海马和皮层区域的神经元凋亡。细胞实验显示,t-BHQ降低了PbAc诱导的SH-SY5Y细胞内ROS的积累和Capsase 3/7活性,但增加了胞内GSH含量。t-BHQ促进了Nrf2转位入核并与ARE结合,虽然Nrf2的转录水平未见上升,但促进了Hmox1、Nqo1和Gclc等基因的表达。当分别敲降SH-SY5Y细胞内Nrf2和HO-1,则观察到细胞的氧化应激水平升高,细胞凋亡增多,t-BHQ的保护作用显著减弱。结论：t-BHQ可通过激活Nrf2/HO-1通路来抑制了铅的神经毒性,发挥细胞保护作用。