猪瘟(Classical swine fever，CSF)是严重危害养猪业的传染病之一，具有高传染性和高致病性的特点。其病原为猪瘟病毒(CSFV)，属黄病毒科瘟病毒属成员。CSFV是有囊膜的单股正链RNA病毒，基因组长约12.3kb。猪瘟病毒在体外细胞系中的增殖只局限于少数猪肾和睾丸细胞。虽然疫苗C株是唯一能在兔体内复制增殖的猪瘟病毒，但它在体外培养细胞中的增殖水平比较低。该特点不仅阻碍了对其弱毒机制研究和新型弱毒标记疫苗的研制，而且也在一定程度上影响了疫苗生产成本。已有研究结果表明，猪瘟病毒在细胞内的增殖可能受多个环节的调控，而疫苗C株在体外适应性的分子基础以及影响C株在细胞中低水平增殖的机制并不清楚。本研究目的是：(1)鉴定与C株传代病毒体外增殖特性相关的差异位点；(2)解析这些位点对C株病毒在细胞内增殖的影响。　　 1、猪瘟病毒疫苗C株持续感染细胞模型的建立　　 以本实验室构建的猪瘟病毒疫苗C株感染性克隆pA-RecC为模板，体外转录RNA并电转于猪肾传代细胞系PK-15中。经连续传代110代，成功建立了稳定的病毒持续感染细胞模型，获得RecC-PK15细胞株。用间接免疫荧光法(IFA)检测RecC-PK15细胞株连续传代中病毒在细胞内的存在情况。结果表明，在传代细胞中均有CSFV存在，并从第十代开始能检测到子代感染性病毒粒子，表现出病毒持续感染的基本特征。　　 2、高、低代次C株传代病毒体外适应性差异及全基因组序列务析　　 通过比较RecC-p40、RecC-p60、RecC-p80和RecC-p110四个代次病毒在PK-15和ST细胞中的生长特性，发现高代次传代病毒的细胞适应能力明显高于低代次病毒，并且它们在ST细胞中的增殖效率明显高于在PK-15细胞中。IFA检测结果同样表明，在感染病毒48、72和96小时后，无论是在PK-15或ST细胞中，高代次传代病毒的荧光斑数量都明显多于低代次传代病毒。对RecC-p40、RecC-p80和RecC-p110三个代次的病毒进行全基因组测序，鉴定出了5个突变位点(26，83，3310，3531，8268)，其中2个位于囊膜糖蛋白E2中，2个位于5’-非编码区，1个位于NS4B非结构蛋白中。　　 3、差异位点对C株病毒体外适应性影响务析　　 为进一步研究C株病毒体外细胞适应性的分子机制，构建并拯救了5株携带上述核苷酸单一突变的重组病毒，并应用IFA、Real-time PCR和病毒感染滴度(TCID50)测定技术，分别从病毒抗原、病毒基因组RNA复制水平和病毒感染滴度变化三个方面，以RecC-p80传代病毒为对照，对它们的体外生长特性进行了比较。结果显示，5株病毒的荧光斑数量基本无差异，RNA复制能力基本一致。但病毒滴度结果表明，T3310G突变株与对照株能检测到的子代感染性病毒粒子量明显多于其余突变株。以上结果说明T3310G突变位点有可能是影响病毒组装、释放过程的关键位点。　　 上述试验结果为深入开展CSFV疫苗C株体外适应性分子机制的研究和新型高效疫苗开发奠定了良好基础。