眼刺激是指外源化学物接触眼表面后使眼产生的可逆性炎症反应。上世纪40年代Draize等创立了家兔眼刺激性试验（Draizetest），此试验一直应用于化学物的眼刺激性检测。几十年来，Draize试验在化学物的眼刺激性毒理学安全性评价，保护人群健康方面做出了巨大贡献。近年来，随着科学技术的进步，社会动物福利和动物保护意识的提高，“3R”理论（减少Reduction，优化Refinement，替代Replacement）的不断深入人心，同时鉴于Draize试验本身存在评分标准主观性强，实验室间检测结果重复性差和造成动物较大痛苦等缺点，Draize试验面临着越来越多的批评和谴责。为此欧盟（European Union，EU）、美国、日本及其他国家和地区开展了有关眼刺激性试验替代方法的研究与评价工作，2003年欧盟在化妆品规程（76/768/EEC）第7次修正案（2003/15/EC）中明确规定：从2009年起在欧盟范围内禁止使用动物进行化妆品毒性和过敏试验，2013年禁止使用动物进行化妆品及原料的毒理学安全性评价，逐步不允许成员国从外国进口和销售进行过动物试验的化妆品。自二十世纪八十年代国外学者开始探索用离体试验方法替代整体动物试验以来，眼刺激性体外替代方法的研究取得了较大进展，建立了离体器官模型、绒毛膜尿囊膜试验、体外细胞毒性与功能试验、体外组织重组模型等多种体外方法，在此基础上部分研究者还推荐通过合适的统计学方法和检测策略以增强它们应用的有效性。我国有研究者对眼刺激试验的替代方法进行了初步的探索，先后建立了鸡胚绒毛膜尿囊膜试验、绒毛膜尿囊膜—台盼蓝染色试验、3T3成纤维细胞中性红摄取试验、荧光素漏出试验以及红细胞溶血试验等眼刺激试验的替代方法，但研究发现各种方法均有其适用范围和局限性，迄今在应用上尚不能直接使用单一方法替代整体动物试验，迫切需要针对多个观察终点建立更多的替代试验方法，进而建立综合检测策略。而我国在此方面与国外相比差距仍较大，为了加速我国同国际接轨的步伐，使我国化妆品出口能早日打破贸易技术壁垒，也使我国对进口化妆品的毒理学安全性评价技术与国际通用方法体系对接，很有必要建立更多适合我国国情的眼刺激性试验替代方法，以期将多种方法有机组合、优势互补、最终构建检测策略，为眼刺激性体外替代方法应用于化妆品及其他化学物（工业化学品、农药和消杀产品等）的毒理学安全性评价工作提供科学依据。 研究目的: 1．通过探索离体兔眼（isolatedrabbiteye，IRF）刺激性试验的试验条件和研制“离体眼球表面灌流系统”，建立及评价IRE试验方法。 2．应用IRE试验和传统的Draize试验对26种参照化学物和26种化妆品的眼刺激性进行捡测，评价分级结果的相关性和一致性、IRE试验的可靠性以及IRE试验对不同刺激性受试物的预测能力。 材料与方法: 1．受试物 26种参照化学物（均为化妆品原料）和26种洗发护发类、染发类、烫发类和洗面奶类化妆品。 2．传统的动物眼刺激性试验参照我国卫生部《化妆品卫生规范》（2007年版），选用健康成年白色新西兰家兔进行传统的整体动物眼刺激性/腐蚀性试验，即Draize试验。 3．离体眼球表面灌流系统的研制及功能评价在文献报道基础上，应用仿生学原理，结合本实验室实际情况，自行设计制作离体眼球表面灌流系统，从而达到离体眼球体外维持的目的。 选取8只经检测未发生损伤的离体兔眼，将离体兔眼置于表面灌流系统中，在0．5h、1h、2h、3h、4h观察离体兔眼的角膜混浊度、荧光素滞留、角膜水肿率及病理学改变，从而判断离体眼球表面灌流系统对离体兔眼的体外维持效果。上述试验共进行三次，以了解该系统维持能力的稳定性。 4．IRE试验方法的建立及受试物的检测IRE试验参照欧洲替代方法验证中心（EuropeanCentrefortheValidationofAlternativeMethods，ECVAM）推荐的试验方法进行。第一阶段选用部分受试物采用4s、10s和30s三种不同的处理时间进行IRE试验，确定最佳的受试物处理时间。第二阶段和第三阶段采用第一阶段确定的处理时间对全部参照化学物和化妆品进行检测。 5．数据处理及统计分析采用SPSS（ver16．0）统计软件对IRE试验与Draize试验的眼刺激性分级结果进行Pearsonχ2检验、McNemar—Bowker、Gamma和Kappa统计学分析。对26种参照化学物所进行的三次IRE试验分级结果进行方差分析，以了解IRE试验的可靠性。以Draize试验分级结果作为“金标准”，分别计算IRE试验检测不同刺激性受试物的灵敏度、特异度和受试者工作特征曲线（receiveroperatorcharacteristiccurve，ROC）下面积，以评价IRE试验对不同眼刺激性受试物的预测能力。 结果: 1．IRE试验方法的建立1．1离体眼球表面灌流系统的研制及功能评价在研究中，成功设计制作了一套具有自主知识产权的“离体眼球表面灌流系统”。目前该系统已申报国家发明专利（专利申请号：200810219435．X）。 正常离体眼球置于该系统中4h内，未见明显角膜混浊、荧光素滞留、角膜水肿率和病理学改变。三次试验平均角膜水肿率分别为2．06％±1．63％、2．83％±1．93％、2．03％±1．19％，均小于试验要求的7％，说明该系统可以稳定地维持角膜的形态，确保IRE试验期间离体兔眼的形态和功能满足试验需要。 1．2IRE试验受试物处理时间的确定处理4s、10s和30s进行的IRE试验和Draize试验分级的等级相关系数SpearmanR分别为0．816（P＝0．007）、0．930（P=0．000）和0．776（P=0．014）。结果可见受试物处理4s时低估了部分受试物的眼刺激性、处理30s时高估了部分受试物的眼刺激性，受试物处理10s时IRE试验与Draize试验结果一致性相对较好，以此确定10s作为正式试验的受试物处理时间。 2．26种参照化学物的IRE试验结果及其分析2．1IRE试验和Draize试验眼刺激性分级结果的相关性和一致性分析26种参照化学物的IRE试验和Draize试验分级结果具有较高的等级相关性（SpearmanR=0．943，P＝0．000；Gamma=1．000，P＝0．000）及分级一致性（Kappa=0．799，P=0．000），两种试验方法分级结果的差别无统计学意义（McNemar—BowkerW=5．00，P=0．172）。 2．2IRE试验的可靠性分析26种参照化学物进行三次IRE试验检测显示，对于大多数参照化学物三次IRE试验分级结果一致，方差分析发现三次分级结果间的差别无统计学意义（F=0．439，P=0．646），说明IRE试验方法可靠具有良好的可重复性和稳定性。 2．3IRE试验对不同眼刺激性参照化学物的预测能力分析IRE试验预测无刺激物的灵敏度为100％、特异度为93．9％、ROC曲线下面积=0．957（P=0．035）；预测轻刺激物的灵敏度为84．6％、特异度为95．5％、ROC曲线下面积=0．900（P＝0．000）；预测中刺激物的灵敏度为88．9％、特异度为87．5％、ROC曲线下面积=0．882（P＝0．002）；预测强刺激物的灵敏度为81．8％、特异度为100％、ROC曲线下面积=0．909（P=0．001）。 3．26种化妆品的IRE试验结果及其分析3．1IRE试验和Draize试验眼刺激性分级结果的相关性和一致性分析26种化妆品的IRE试验和Draize试验分级结果具有较高的等级相关性（SpearmanR=0．699，P=0．000；Gamma=0．893，P=0．000）及分级一致性（Kappa=0．553，P=0．001），两种试验方法分级结果的差别无统计学意义（McNemar—BowkerW=1．667，P＝0．435）。 3．2IRE试验对不同眼刺激性化妆品的预测能力分析IRE试验预测无刺激物的灵敏度为84．6％、特异度为69．2％、ROC曲线下面积=0．852（P=0．000）；预测轻刺激物的灵敏度为44．4％、特异度为88．2％、ROC曲线下面积=0．639（P＝0．247）；预测中刺激物的灵敏度为100％、特异度为95．5％、ROC曲线下面积=0．977（P＝0．003）。 结论: 1．通过对“离体眼球表面灌流系统”的研制，并对受试物处理时间等试验条件进行探索，在我国率先建立了离体兔眼试验的试验方法。 2．26种参照化学物和26种化妆品的IRE试验与Draize试验眼刺激性分级结果具有较高的相关性和一致性，IRE试验对受试物的眼刺激性具有较高的预测能力，试验方法较为稳定，结果可重复性和可靠性良好。 3．IRE试验通过角膜混浊度、荧光素滞留程度、角膜水肿率和组织病理学改变等多个指标反映受试物造成眼角膜损伤的能力，适用于检测以角膜损伤为主的眼刺激性物质。 4．IRE试验适用于中等和强刺激物的检测，可应用于眼刺激试验检测策略中中等和强刺激物眼刺激性的初筛。 5．本研究中成功研制了离体眼球表面灌流系统，该装置也可望用于其他动物离体眼球模型应用于眼刺激试验替代方法的研究。