目的:　　EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）属人类γ疱疹病毒，在全球广泛分布，约95％以上的成人所携带，呈潜伏感染状态，与鼻咽癌、Burkitt淋巴瘤等多种肿瘤的发生、发展相关。在EBV潜伏感染的细胞中，表达十多种EBV基因产物，包括EBV核抗原(EB nuclear antigen，EBNA)1、2、3A、3B、3C和LP，潜伏膜蛋白(latent membrane protein，LMP)1和2A、2B，EBV编码的小RNA(EBER)1和2以及BamHⅠ的转录产物。近年许多关于LMP2A的研究报道指出，EBV潜伏感染的B细胞中均有LMP2A的表达，鼻咽癌和其他EBV相关恶性肿瘤中可持续检测到LMP2A的转录表达产物(mRNA)，LMP2A可在没有BCR提供信号的情况下促进B细胞的增殖和存活，并且LMP2A是鼻咽癌、淋巴瘤等肿瘤细胞稳定表达的EBV保守抗原，在维持病毒的潜伏感染状态和细胞转化过程中发挥重要作用，并参与调节跨膜信号的转导。目前认为LMP2A是鼻咽癌等EBV相关恶性肿瘤免疫治疗的理想靶抗原。　　本研究运用基因工程技术选择抗原性较强的两个LMP2A胞外区表位基因并将其串联，连接载体后导入大肠杆菌中表达LMP2A表位融合蛋白，并检测其免疫原性;应用杂交瘤技术，制备抗LMP2A的特异性单克隆抗体，对该单克隆抗体进行鉴定和免疫学功能分析;应用纯化后的单克隆抗体进行EBV相关鼻咽癌病人的免疫组化检测，为进一步进行鼻咽癌诊断和分子靶向治疗奠定基础。　　方法:　　1.LMP2A重组表位融合蛋白基因的串联以及构建融合蛋白原核表达载体　　依据Genebank中的LMP2A基因序列以及大量相关文献，且经软件分析后选择抗原性较强的LMP2A第二位和第五位表位基因，优化LMP2A表位基因序列并将LMP2A第二、五胞外区基因串联，限制内切酶在5端和3端双酶切位点BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切，将重组串联基因克隆于pET28a原核表达载体中，构建LMP2A表位融合蛋白的重组表达载体。　　2.LMP2A重组表位融合蛋白的表达、纯化与鉴定　　将原核重组表达载体pET28a-LMP2A转化至大肠埃希菌BL21中诱导LMP2A融合蛋白的表达。表达的蛋白变性处理后用Ni-NTA亲和层析柱纯化，复性后进行SDS-PAGE电泳并用Coomassie blue染色、脱色、鉴定蛋白纯度。用商品化大鼠抗人LMP2A IgG对纯化后的LMP2A重组表位融合蛋白进行Westernblotting鉴定。　　3.抗LMP2A单克隆抗体的制备与纯化　　以纯化后的LMP2A重组表位融合蛋白作为抗原免疫小鼠，取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，HAT培养基选择培养，经克隆以及多次亚克隆后筛选出能够稳定分泌鼠抗人LMP2A的杂交瘤细胞株。取杂交瘤细胞注射入小鼠腹腔经腹水诱生方法产生腹水。经亲和层析柱Protein G纯化，测定抗体浓度。　　4.抗LMP2A单克隆抗体的亚类分析、鉴定及免疫学功能分析　　纯化后的单克隆抗体经免疫球蛋白亚类测定试剂盒测定抗体的亚类，ELISA测定其效价，SDS-PAGE鉴定抗体重轻链，以及一系列免疫学功能分析，包括Western blotting、免疫荧光、流式细胞术等。　　5.单克隆抗体的免疫组化检测　　收集33例鼻咽癌患者组织石蜡标本，切片脱蜡至水，以纯化后单克隆抗体为一抗并以无关抗体作为对照，检测EB病毒相关鼻咽癌病人组织切片中LMP2A蛋白的表达。　　结果:　　1.EB病毒LMP2A重组表位融合蛋白基因的构建、蛋白的表达与纯化　　经DNAstar软件分析LMP2A编码基因序列，LMP2A第二、五胞外区重复串联基因与原先设计的目的蛋白序列一致，转化大肠埃希菌BL21，诱导表达的LMP2A重组融合蛋白纯化后经Western blotting，SDS-PAGE鉴定，提示蛋白的分子量约为12KDa。运用该融合蛋白制备的血清抗体经ELISA及SDS-PAGE、Western blotting检测提示该融合蛋白效价高且具有较好的免疫原性。　　2.抗LMP2A单克隆抗体的制备、鉴定与免疫学功能分析　　以LMP2A重组表位融合蛋白为抗原免疫小鼠，经两次亚克隆筛选出一株稳定分泌抗LMP2A抗体的杂交瘤细胞株，定株命名为5C12-C4-A6。取杂交瘤细胞注射小鼠腹腔产腹水纯化后，亚类分析为IgG1，轻链为κ，ELISA结果提示该抗体效价在1∶128000以上，Western blotting、免疫荧光、流式细胞术结果均提示该抗体能够与细胞中的LMP2A蛋白特异性结合。　　3.抗LMP2A单克隆抗体的临床相关应用　　收集33例鼻咽癌患者组织石蜡标本，以抗LMP2A单克隆抗体为一抗进行免疫组化检测，在33例鼻咽癌组织切片中31例出现阳性反应，定位在胞膜与胞浆，阳性率为93.94％，结果提示该抗体能够与鼻咽癌组织中天然构象的LMP2A抗原特异性结合。　　结论:　　本研究成功构建并表达了LMP2A重组串联表位融合蛋白;并利用纯化后的融合蛋白制备出了一株抗人LMP2A特异性单克隆抗体，鉴定结果提示该单抗能够与LMP2A蛋白特异性结合，并可与鼻咽癌细胞以及鼻咽癌组织切片中的天然构象的LMP2A蛋白特异性结合，为今后的鼻咽癌诊断及分子靶向治疗奠定了基础。