杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy，DMD; OMIM310200)是一种神经肌肉系统常见的X-连锁隐性遗传病，主要累及男婴，在存活男婴中发病率约1/3500～1/6000，其主要临床特征为缓慢进行性加重的对称性肌肉无力和萎缩，患者多起病于3～5岁，出现走路姿势异常、易跌倒、肌无力等症状，12岁前丧失站立和行走能力，20岁左右死于呼吸困难、心力衰竭。本病是由位于Xp21.2的dystrophin基因突变导致，该基因全长约2.4Mb，约占X染色体全长的1.5％，是目前人类已发现的最大基因，其cDNA全长13974bp，共有79个外显子，其编码一种相对分子质量为32万道尔顿的肌养蛋白。近65％患者由一个或多个dystrophin基因外显子的缺失所致，5％由重复突变导致，30％由点突变导致。　　胚胎植入前遗传学诊断(Preimplantation genetic diagnosis，PGD)可通过筛选正常的胚胎移植，以防止遗传学异常妊娠的发生，避免了反复流产、引产对孕妇及其家庭造成的伤害。　　目前已有DMD-PGD相关报道，多重巢式PCR、连锁分析、限制性酶切等方法都在其PGD考虑之中，但这些方法仅限于对单细胞几个位点进行直接扩增，有位点少、扩增效率低、不能重复、条件要求高等缺点。对于临床PGD十分不利，因此全基因组扩增将模板量大幅提高，避免上述问题的产生。目前全基因组扩增已发展出引物延伸预扩增(Primer extension preamplification，PEP)技术和简并寡核苷酸引物 PCR(Degenerate oligonucleotide primed-polymerase chainreaction，DOP-PCR)技术及多重置换扩增技术(multiple displacementamplification，MDA)。MDA技术已成为目前最有发展前景的WGA技术。　　目的:　　本研究通过使用多重巢式PCR和MDA的全基因组扩增技术对4个DMD家系完成PGD预实验，在实验中优化DMD-PGD预实验流程，并对多重巢式PCR和MDA-WGA方法对单细胞的扩增效率及诊断准确率和ADO发生率进行评估，对DMD-PGD中现有的10个STR位点进行有效率评价，最后对其中存在的问题进行讨论分析。　　材料:　　本研究材料来自4个家系中患者或（和）其直系亲属，患者及相关成员外周血标本于我院遗传中心抽取，并进行抽提gDNA和分离单淋巴细胞。　　家系Ⅰ:分子编号M13742，家系中女性携带者年龄34岁，生育一患儿，基因诊断提示女性携带者的dystrophin基因第12-16号外显子杂合缺失;　　家系Ⅱ:分子编号M5841，家系中女性携带者年龄41岁，生育一患儿，基因诊断提示女性携带者的dystrophin基因存在c.7705C＞T杂合无义突变，并曾经行连锁分析;　　家系Ⅲ:分子编号M13501，家系中女性携带者年龄41岁，生育一患儿，14岁夭折，但未保留样本，基因诊断提示女性携带者的dystrophin基因存在c.6318G＞A杂合无义突变，取女性携带者及其父母血样;　　家系Ⅳ:分子编号M13691，家系中仅有患儿，为新发生突变，基因诊断提示患儿的dystrophin基因存在第48-52号外显子缺失，其母亲则未见异常，年龄40岁。　　方法:　　1、制备单个淋巴细胞和抽提外周血gDNA　　2、家系gDNA水平PCR扩增和荧光-PCR扩增，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和荧光电泳对DMD-STR位点2CA、5CA、7CA、44CA、45CA、49CA、50CA、59CA、63CA、79CA进行连锁分析，确定能提供连锁信息的位点。　　3、单个淋巴细胞通过多重巢式PCR或MDA-WGA进行初级扩增　　4、多重巢式PCR初级扩增产物和MDA纯化产物各位点的荧光PCR的扩增　　5、通过测序仪荧光电泳对荧光PCR产物进行分析及通过琼脂糖凝胶电泳对缺失位点普通PCR产物进行分析　　6、对需要测序的PCR产物进行回收、纯化及测序分析　　结果:　　1、单体型分析结果　　家系Ⅰ单体型分析结果，能提供连锁信息位点共4个，分别为5CA、44CA、45CA、50CA;家系Ⅱ单体型分析结果，能提供连锁信息位点共3个，分别为44CA、49CA、50CA;家系Ⅲ单体型分析结果，能提供连锁信息位点共4个，分别为7CA、44CA、50CA、63CA;家系Ⅳ单体型分析结果，能提供连锁信息位点共6个，分别为2CA、5CA、44CA、45CA、59CA、63CA。　　2、各家系单淋巴细胞扩增效率及ADO率　　家系Ⅰ共完成184个位点的扩增，扩增成功及诊断准确率99.5％(183/184)、ADO率为0，家系Ⅱ共完成153个位点的扩增，扩增成功及诊断准确率为99.3％(152/153)、ADO率为0，家系Ⅲ共完成180个位点的扩增，扩增成功及诊断准确率为100％(180/180)、ADO率为1.1％(178/180)，家系Ⅳ共完成480个位点的扩增，扩增成功及诊断准确率为99.8％(479/480)、ADO率为0。　　3、多重巢式PCR方案和MDA-WGA方案的扩增效率及ADO率比较　　运用多重巢式PCR扩增方案总共扩增产物337个，扩增成功及诊断准确率为99.4％(335/337)，ADO率为0(0/335);运用MDA-WGA方案总共扩增产物660个，扩增成功率为99.8％(659/660)，ADO率为0.3％(2/659)。经x2检验，两者扩增成功率P＞0.05差异无统计学意义，ADO率P＞0.05，无统计学意义。　　结论:　　1、本实验共完成了4家DMD家系的PGD预实验，单细胞多重巢式PCR方案和MDA-WGA方案的各位点扩增成功率均＞90％，ADO率均＜10％，达到临床PGD要求，能够应用于临床PGD，这为DMD患者的临床PGD的开展提供了强有力的技术支撑。　　2、虽然多重巢式PCR方案和MDA-WGA方案的扩增成功率和ADO率无统计学差异。但MDA-WGA在多位点分析上更有优势，这样能更有效地提高单细胞诊断DMD的准确率。　　3、多位点连锁分析不仅能监测污染的发生，同时也能完成PGD诊断分析，拓宽了PGD的诊断范围，增加了PGD诊断的准确性，降低了误诊的发生。