日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)是一种蚊媒病毒，主要流行于亚洲，是病毒性脑炎的重要病原，给人类健康带来重大危害。JEV属于黄病毒科的黄病毒属，其囊膜蛋白(E)是主要的结构蛋白，在病毒的吸附、膜融合等入侵过程起着重要的作用。研究E蛋白的结构和功能对病毒入侵机制的揭示有重要意义。　　第一章首先简介了JEV的基本特征，包括JEV的分子生物学、病原学、病理学等特征，此外还包括JEV的诊断、治疗和预防方法等。随后，本章综述了JEV的入侵机制以及E蛋白结构和功能的研究进展，并重点讨论了E蛋白在JEV入侵中的作用。本章最后介绍了本论文的研究内容和意义。　　第二章利用杆状病毒表达系统，本研究对E蛋白的翻译后加工过程进行了讨论。在传统观点中，前体膜蛋白(prM)作为伴侣蛋白在E蛋白的成熟过程起到重要作用，然而本研究发现，在昆虫细胞Sf9中共表达prM和E或单独表达E蛋白均可以诱导细胞产生合胞体，提示在不依赖prM蛋白共表达的条件下，E蛋白同样成熟并保留膜融合功能。免疫荧光、Western blot以及电镜观察等表明E蛋白单独表达时主要定位于细胞膜表面，且能组装VLPs，提示其诱导相邻细胞膜融合的方式可能为FFWI或FFWO。此外，在Sf9细胞培养上清中添加E蛋白特异抗体可以显著抑制JEV E蛋白诱导的合胞体形成，提示一种新型的安全简便的方法，能够用来筛选针对JEV的膜融合过程的抗病毒抗体、多肽或小分子化合物等。　　第三章本研究报道了JEV入侵的一个新的关键因素游离巯基。E蛋白含有12个保守的半胱氨酸，晶体结构研究表明这12个半胱氨酸形成6对分子内二硫键。本研究表明，E蛋白中并非所有半胱氨酸都参与二硫键的形成，还有半胱氨酸以还原形式存在。利用AMS烷基化病毒表面游离巯基显著降低感染力，说明游离巯基在病毒的入侵过程起着重要作用。利用AMS标记以及生物素-马来酰亚胺(MPB)标记实验在E蛋白中检测到游离巯基。质谱分析进一步表明5个半胱氨酸可能处于还原状态。定量实验表明，AMS烷基化有效抑制病毒吸附，提示游离巯基在病毒与受体结合中的重要作用。早期研究表明E蛋白DⅢ是主要受体结合结构域，而在质谱鉴定的5个还原形式的半胱氨酸中，Cys304位于EDⅢ，说明Cys304可能在病毒吸附过程起到重要作用。对应E蛋白289-314位氨基酸的多肽(P304-WT)含有还原形式的Cys304，且能与细胞特异吸附，而AMS烷基化阻断这种吸附，进一步表明Cys304中游离巯基在受体结合中的重要作用。Cys-Ser突变并不影响P304-WT的细胞吸附能力，提示AMS抑制细胞吸附的原因可能是AMS修饰破坏了受体结合所需的特殊构象。总之，本研究首次报道了E蛋白中游离巯基的存在及其在病毒入侵（受体结合）中的作用，为新型疫苗或抗病毒新药的研发提供了新的靶点。　　第四章本研究建立了JEV的反向遗传学系统。通过缺失JEV结构基因将基因组截短形式构建到CMV启动子下作为基础质粒，该质粒可在大肠杆菌稳定复制。缺失的结构基因片段可通过融合PCR引入突变及扩增，之后与线性化的基础质粒体外连接形成全长cDNA感染性克隆。将连接体系直接转染受纳细胞，培养3-5天后即可收获恢复病毒。该系统避开了JEV全长cDNA克隆在大肠杆菌中不能稳定存在的问题，且相较于传统的JEV反向遗传系统，该系统具有快速简便的优点，为病毒复制、病毒宿主相互作用以及疫苗研发等研究提供了基础。　　第五章对本论文的研究内容进行了总结和讨论。本论文对JEV囊膜蛋白E在病毒入侵中的作用机制进行了研究，并为E蛋白与受体的相互作用研究提供了线索。利用原核表达、生化标记配合结构生物学以及反向遗传学等手段可以对此进行更深入的探讨。