论文部分内容阅读
动物性腺的分化和发育一直是人们研究的热点,对生物学基础研究和繁殖疾病的治疗等方面有重要意义。研究发现哺乳动物性别开关基因SRY,而禽类的性别决定和性腺发育调控机制还不清楚。本实验室筛选出早期鸡胚性腺发育过程中雌、雄个体差异表达基因CDK2AP1,在小鼠中的研究发现它对性腺的发育起着重要作用。本研究利用超表达和RNAi干涉技术,在DF-1细胞中研究该基因与鸡胚性腺发育生长相关基因间的调控关系,初步确定它在鸡胚性腺发育中的功能。研究结果如下：1. WISH检测CDK2AP1在3.5d (St22)和4.5d (St25)鸡胚以及5.5d (St28)和6.5d(St30)泌尿生殖系统中的表达,结果显示该基因在3.5d(St22)和4.5d(St25)胚胎多种组织中均有表达,头部和四肢尤为明显,且雌、雄鸡胚差异显著。它在5.5d(St28)雌、雄性腺中表达差异不明显,6.5d(St30)雌性性腺中表达量高于雄性；在5.5d(St28)雌、雄性腺中表达范围和强度大于6.5d(St30)。2.构建了CDK2AP1超表达载体RC ASBP.B-CDK2AP1-GFP和三个CDK2AP1干涉载体RCASBP.B-GFP-U6-shRNA (UCR1、UCR2、UCR3),体外超表达和干涉CDK2AP1,结果显示CDK2AP1在超表达组中表达量(qPCR和WB检测)显著上升,在UCR1和UCR3干涉组中显著下降(P<0.01), UCR1干涉效果最好而UCR2干涉效果不明显(P>0.05)。3.分析了CDK2AP1与性腺发育和分化相关基因的调控关系,qPCR和WB结果一致显示CDK2AP1能显著上调AR(P<0.01)和FOXO3a表达水平(P<0.05), qPCR表明它可调控ERa的表达；显著下调CDK2表达量；而对EMT调控因子TWIST2表达水平没有显著影响(P>0.05)。可初步确定CDK2AP1可调控性腺发育相关基因AR、ERa和FOXO3a,以及CDK2表达水平,促进雌、雄性腺的发育。4.流式细胞仪检测超表达和干涉处理后细胞周期的改变,结果显示CDK2AP1超表达组,G1期细胞比例显著上升(P<0.01),S期和G2/M期细胞比例显著下调(P<0.01)；干涉处理组中G1期细胞比例显著下降(P<0.01),S期细胞比例与空白组之间无差异(P>0.05),G2/M期细胞比例显著上升(P<0.01)。结合qPCR结果,可确定CDK2AP1可通过负调控CDK2,使细胞周期停滞在G1期从而抑制细胞生长。