香蕉枯萎病菌及其毒素致病机制的研究

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本文对湛江市香蕉枯萎病(4号生理小种)发生情况进行全面的调查,并对病原菌[Fusarium oxysporum f.sp.cubense(E.F.Smith)Snyder et Hansen]4号生理小种进行了以下几方面的研究:病原菌对不同品种香蕉防御酶系的影响;病原菌最佳的产毒条件:病原菌毒素的提取、成分分析以及生物测定;病原菌毒素对不同品种香蕉苗叶片超微结构的影响。 2005年至2006年间,在湛江市范围内对香蕉枯萎病的分布和发病率进行调查,调查结果表明,在湛江市,除了雷州和遂溪之外,其它地区的香蕉种植地都不同程度的出现了香蕉枯萎病,其中以硇洲岛最为严重。 在防御酶系的研究中,新北蕉(耐病品种)蕉苗经病原菌接种后,PO和PAL酶活性虽然没有明显表现出比感病品种8818蕉苗和巴西蕉苗的PO和PAL酶活性高。但从酶活性的增加变化状况来看,新北蕉蕉苗的PO和PAL酶活性仍是比两个感病品种的强,具有潜在的酶活性增强趋势,因此这两种酶的活性变化反映了这三个香蕉苗品种间的耐、感病关系。然而,对SOD酶活性的测试结果表明,耐病品种的SOD酶活性明显的比感病品种的低,而且相差的幅度很大,这可能说明了SOD的酶活变化与香蕉苗的耐、感病关系呈负相关。对于几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性的变化,试验结果表明:耐病品种经病原菌处理后,其几丁质酶活性(包括内切几丁质酶和外切几丁质酶)比感病品种的高;β-1,3-葡聚糖酶的活性在酶活数值上耐、感品种间没有表现出明显的差异,但耐病品种的从接种后,一直处于不断增强的状态,直到在120小时处形成一个酶活性高峰后才回落,而两个感病品种的则没有此趋势。 在产毒条件的研究中,病原菌在供试的液体培养基中都可以产生对香蕉苗有毒性作用的毒素。不同培养液的产毒能力有明显的差异,经测试的6种培养液中以Richard培养液产毒能力最强。香蕉枯萎病菌以温度为20℃,pH为7~9,振荡培养(140次/min),培养10~15d后达到产毒高峰。试验还表明,经浓缩或121℃,15磅/时<2>高温高压灭菌30min的培养滤液,其毒素作用明显增强。 在明确了香蕉枯萎病菌4号生理小种的最佳产毒条件之后,对毒素的成分和生物活性进行了分析。培养了15d的培养滤液,经无菌处理后进行浓缩,再用乙酸乙酯萃取,有机相浓缩至干,95%乙醇重溶并过滤,乙醇自然挥发干或45℃烘干即得毒素的粗提物。粗提物用乙醚进一步纯化后进行成分分析。经高效液相色谱和色谱/质谱(GC/MS)鉴定以及生物活性测试表明:镰刀菌酸(fusaric acid)是毒素中的主要成分,是主要的致枯萎物质;此外,还有其它成分与镰刀菌酸一起成为香蕉枯萎的致病因子。生物测定显示:该毒素是一种非寄主专化性毒素,对不同品种的蕉苗、不同科属作物幼苗均存在明显的毒害作用;对不同科属作物种子的萌发和胚芽的生长也具有明显的抑制作用;毒害作用随着毒素溶液浓度的升高而加强。此外,本实验用香蕉枯萎病菌毒素和纯品镰刀菌酸对新北蕉和巴西蕉幼苗叶片进行处理,以观察叶片超微结构发生的变化。结果表明:毒素溶液处理后,细胞发生质壁分离;叶绿体数量及其内部的淀粉颗粒数量显著减少,叶绿体内出现大量的嗜锇颗粒,叶绿体片层膨胀扭曲并分解:线粒体变形,脊数量减少,最终膜局部破裂,内含物外流。耐病品种对毒素表现出较强的耐性,叶片超微结构造到破坏的程度没有感病品种的严重。此外,毒素处理和镰刀菌酸处理的对照试验结果表明:镰刀菌酸对叶片超微结构的破坏与毒素的相似,但破坏出现的时间晚且程度轻。
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