第一部分 人脂肪细胞中PGC-1的表达及调控 目的：胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)贯穿于2型糖尿病发生发展的整个过程，是2型糖尿病发病的重要基础。而脂肪组织在胰岛素抵抗的发生中起着重要作用，很多资料显示，肥胖与胰岛素抵抗有高度相关性。而且，脂肪组织作为新的内分泌器官，分泌的一些激素和细胞因子与胰岛素抵抗密切相关。 过氧化物酶体增生激活受体γ协同刺激因子α(PGC-1)是近年来发现的一种转录协同刺激因子。它被认为在适应性产热、线粒体生成、脂肪酸β氧化及肝糖异生等过程中有着重要作用。肝脏中的PGC-1表达增加，能增加肝糖输出，促进糖异生；肌肉组织中的PGC-1可增加GLUT4的表达，通过增强葡萄糖的转运，降低血糖。 对于PGC-1与糖尿病的关系得研究，主要集中在肝脏和肌肉。而关于脂肪组织的研究尚少，因此，本研究主要观察PGC-1在糖尿病人及正常人脂肪组织中的表达，PGC-1在体外培养的脂肪细胞中的表达及其调控因素。另外，我们还构建了PGC-1的慢病毒表达载体及PGC-1 siRNA的慢病毒载体，观察转染这些构建的慢病毒后对脂肪细胞中PGC-1下游基因的影响。 方法：RT-PCR和Western-blot检测糖尿病人和正常人皮下脂肪组织中PGC-1的表达；流式细胞仪和油红染色鉴定ADSCs和分化成熟的脂肪细胞；RT-PCR和Western．blot检测TNF-α和吡咯列酮对脂肪细胞中PGC-1的影响；将PGC-1慢病毒和PGC-1 siRNA慢病毒分别转染脂肪细胞，R1-PCR观察转染病毒后对脂肪细胞中PPAR-γ和GLUT4的影响。 结果：糖尿病人和正常人相比，皮下脂肪组织中PGC-1的表达显著升高； 1ng/ml的TNF-α刺激脂肪细胞后，随着时间的延长，PGC-1的表达增加。而10ng/ml的TNF-α刺激脂肪细胞后，随着时间的延长，PGC-l的表达下降；吡咯列酮处理脂肪细胞后，PGC-1的表达呈时间依赖性增加；PGC-l慢病毒转染脂肪细胞后，PPAR-γ和GLUT-4的表达增加。PGC-1 siRNA慢病毒转染脂肪细胞后，PPAR-γ和GLUT-4的表达下降。 结论：糖尿病人外周皮下脂肪中PGC-l的表达升高；TNF-α和吡咯列酮参与对脂肪细胞中PGC-1的调控；脂肪细胞中PGC-1能够促进PPAR-γ和GLUT-4的表达。 第二部分携带PGC-1和PGc-1 siRNA慢病毒载体的构建与表达 目的：过氧化物酶体增生激活受体γ协同刺激因α(PGC-1)是近年来发现的一种转录协同刺激因子。它在不同的细胞发挥着不同的作用。慢病毒载体因为能够转染非分裂期细胞和分裂期细胞，携带的遗传信息能够整合到宿主的基因组，实现目的基因长期稳定的表达而成为应用范围日益广泛的病毒载体。因此我们构建了PGC-1慢病毒表达载体和：PGC-1 siRNA慢病毒载体，观察转染病毒后对ADSCs及脂肪细胞的影响。 方法：将PGC-1全长克隆到pWPXL质粒，PGC-1 siRNA连接到pLVTHM质粒。包装病毒后，流式细胞仪检测病毒滴度；MTT和流式细胞仪检测转染病毒后对细胞的影响；RT-PCR检测转染病毒后PGC-1的表达。 结果：随着病毒滴度的增加，转染效率逐渐增加。病毒滴度为0.1和0.5时，对细胞增殖有轻度刺激作用，对细胞凋亡没有影响。病毒滴度升高后，转染早期能抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡。PGC-1慢病毒载体能够升高脂肪细胞中PGC-1的表达，PGC-1 siRNA慢病毒载体能够抑制脂肪细胞中PGC-1的表达结论：慢病毒载体能够长期有效的转染ADSC<,S>和脂肪细胞。