背景：　　 瘢痕疙瘩是整形外科的常见疾病，表现为瘢痕组织过度生长，侵犯邻近组织，它和良性肿瘤的生物学行为相似，由于其各种临床治疗效果均不佳，瘢痕疙瘩发病机制也未明确，故其已成为目前整形外科的探索热点。　　 作为一种慢性的炎性的纤维增生性疾病，瘢痕疙瘩表现出独特的组织学特征，包括高密度的问充质细胞，大量的不规则螺旋状细胞外基质以及被称为瘢痕疙瘩胶原的增厚的透明胶原束，肥大细胞和淋巴细胞等炎症性细胞的局部浸润，生长因子局部聚集。此外，皮肤病理性瘢痕的成纤维细胞比正常皮肤的成纤维细胞产生更高水平的胶原等细胞外基质。研究显示在成年机体的真皮组织中含有较丰富的问充质干细胞。目前已经从普通啮齿类动物及人类普通真皮中分离并鉴定出皮肤前体细胞，这种细胞表现出集落形成、自我更新、特殊的胚胎及间充质干细胞表面标记和多向分化能力，由于瘢痕疙瘩为皮肤来源的良性肿瘤，并且表现为真皮组织过度增生，因此，我们推测在瘢痕疙瘩真皮组织内也存在类似的干细胞群体。　　 本实验包括以下二部分：　　 实验一人瘢痕疙瘩前体细胞的提取、扩增目的　　 本实验拟建立人瘢痕疙瘩来源的前体细胞的分离、扩增培养方法，并对其进行长期传代后的生物学特性分析(包括形态特征、增殖能力等)。比较KPC和SKP的增殖特性。探索改进现有培养基以获得更好的扩增效果，为下一步实验奠定基础。　　 研究方法：　　 1.取瘢痕疙瘩患者患处、患处与正常皮肤交界处皮肤和正常人皮肤组织在无菌条件下，以PBS(含1％庆大霉素)冲洗2遍后，将组织剪成5～6mm小片，泡入含有3mg/ml中心蛋白酶的PBS中，4℃下孵育过夜。将组织块上层的表皮层轻轻剥离，真皮部分切成1mm3的小块，放入含有4mg/ml胶原酶Ⅰ的PBS中，在37℃下消化2小时。70微米的细胞滤膜过滤，重悬浮细胞接种于未处理的75cm2培养瓶，加以L-DMEM培养基(含10％胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，2mM谷胺酰胺，100mM非必须氨基酸，550uM巯基乙醇)，于标准条件(37℃5％二氧化碳)下培养。待原代细胞生长融合约70～80％后，以1～2×104cells/cm2密度种植并继续以上述培养基培养。　　 2.将同一患者来源的第一代(P1)瘢痕疙瘩前体细胞(KPC)用含2ng/ml bFGF的培养液以相同密度接种于培养瓶中，观察细胞生长增殖情况，并取P5细胞融合达90％的KPC进行细胞计数。调整细胞密度2×103/cm2，然后以每孔相同的细胞数接种于六孔培养板中，于培养后第1～7天每天依次作细胞计数，每次3孔，取平均值，绘制生长曲线。以不含bFGF的培养基培养相同细胞作为对照组。　　 3.取第2代KPC、正常皮肤来源前体细胞(SKP)、瘢痕疙瘩与正常皮肤交界处来源前体细胞(KN)细胞克隆，反复稀释为10个/ml后，将细胞接种于96孔培养板，置于培养箱中培养24h。于倒置相差显微镜下标记单个细胞培养孔，14天后计算其克隆形成率(＞50个细胞记为阳性)。　　 4.将同一患者来源的第2代(P2)KPC、KN细胞，以及正常人的SKP细胞以相同密度接种于上述培养基中，观察细胞生长增殖情况，绘制生长曲线。　　 结果：　　 1.KPC细胞悬液接种于培养瓶后，随着培养时间的延长，悬浮细胞逐渐破碎或坏死，可以通过多次换液清除。细胞可以贴壁生长，不断分裂增殖，呈现成纤维细胞的梭形外观，伴长而粗大的突起，有1～3个核，圆或椭圆形，核仁清晰，约2～5个不等，少数细胞为三角形或多向形，贴壁细胞多聚集成群，以克隆样方式生长，10～14d后，多个克隆可以合成均质的长梭形细胞单层，细胞排列有明显的方向性，呈平行、漩涡状、辐射状排列。SKP、KN细胞镜下外观与KPC无明显差异。　　 2.而用含bFGF的培养基，细胞形态上较纤细、梭长，且细胞增殖速度较快，3～4d后达到80％～90％，随着传代次数增加，增殖速度有所减慢，但仍可传15～20代，而使用不含bFGF培养基培养的KPCs及传代，形态上较宽大、扁平，细胞增殖速度较慢，5～7d后达到80％～90％，随着传代次数的增加，细胞增殖更加缓慢，传至10代时细胞基本停止生长。从增殖曲线结果看，KPCs增殖能力在含bFGF的培养基中＞不含bFGF的培养基(P＜0.05)。　　 3.KPC、SKP、KN细胞单克隆培养的克隆形成率分别为68.7％，54.6％，65.4％。　　 4.KPC和KN细胞较SKP细胞而言，具有较强的增殖能力(p＜0.05)；KPC细胞增殖速度较KN细胞稍快，但无统计学意义(p＞0.05)。　　 结论：　　 1.从瘢痕疙瘩的真皮中可以提取出一种和SKPs类似的成纤维细胞样的细胞。　　 2小剂量bFGF能够促进KPCs的增殖，并能够保持KPCs的细胞形态为长梭形，增加KPCs的传代代数。　　 3 KPC和KN细胞较SKP细胞而言，具有较强的增殖能力(p＜0.05)；KPC细胞增殖速度较KN细胞稍快，但无统计学意义(P＞0.05)。实验二人瘢痕疙瘩前体细胞的鉴定及诱导分化　　 目的：　　 本实验旨在通过流式细胞方法鉴定人瘢痕疙瘩来源的前体细胞，明确其是否为一种类间充质干细胞。并对其是否具有多向分化潜能进行研究。　　 研究方法：　　 1.取KPC细胞(P2、P4)和KN细胞(P2)及正常皮肤SKP细胞(P2)以流式细胞方法测定CD29、CD34，CD44，CD45，CD90，CD105的表达情况。　　 2.取长势良好，细胞融合达80％的P2代KPC及SKP细胞，实验组每孔加入成骨细胞诱导液(OS)(含10-7mol/L地塞米松，10mmol/Lβ-甘油磷酸钠，50ug/ml Vitamin C2m1)；对照组每孔加入含10％FBS的L-DMEM培养液，置培养箱中。隔天换液1次，镜下观察细胞的形态的变化和生长情况。以茜素红S法测定钙结节生成，运用半定量RT-PCR检测成骨诱导分化过程中的成骨细胞相关基因的表达。　　 3.取长势良好的P2代KPC及SKP细胞，按2×108/L密度接种于六孔板。细胞达到完全融合后，加入含1μmol/L的地塞米松，0.5mmol/L的、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(3-isobuty1-1-methy1-xanthine，IBMX)，10mg/L的牛胰岛素，100mmol/L的消炎痛(indomethacin)，10％FBS的H-DMEM诱导3天；再用含10mg/L的牛胰岛素，10％FBS的H-DMEM处理1d。如此循环3次后，用含10mg/L的牛胰岛素、10％FBS的H-DMEM处理7d，每隔3～4d换液1次；对照组加入含10mg/L的牛胰岛素，10％FBS H-DMEM，每隔3～4天换液1次。镜下观察细胞形态的变化和生长情况。以油红O染色法测定脂滴生成。　　 结果：　　 1.流式细胞技术结果显示KPC细胞(P2、P4)、SKP细胞(P2)及瘢痕疙瘩与正常皮肤交界处细胞(KN细胞)(P2)均一性可达95％以上，它们的膜抗原CD34、CD45表达均为阴性，而膜抗原CD29、CD44、CD90、CD105表达均为阳性。　　 2.实验组的KPC及SKP加入OS诱导液后，第二天即可见部分细胞由长梭形逐渐变为立方形，并进而转变为多角形，体积增大。随着培养时间的延长，这种多角形细胞逐渐增多。细胞逐渐聚集形成多个散在的岛状细胞结构。此岛状细胞结构逐渐被分泌的基质所包埋，9天左右出现钙结节，随着培养时间的延长，可观察到较大的细胞结节，有明显的钙沉积。对照组细胞增殖良好，形态不变，为长梭形，见个别宽大、扁平的细胞，随着培养时间延长，呈克隆生长，细胞融合，但不见致密的岛状细胞结构和钙化结节。在成骨细胞诱导培养的第13天用茜素红可检测到钙沉积的情况，实验组镜下可见散在大量橘红色的钙结节，茜素红与钙盐形成的橘红色的复合物，阳性细胞在KPC组镜下见约为70～80％，SKP组约为50～60％。未进行诱导的对照组结果为阴性。抽提总RNA，用半定量的RT-PCR的方法检测成骨相关基因的表达情况，结果显示COL I、BSP等成骨细胞相关性基因在诱导之后表达明显增强。　　 3.KPCs脂肪诱导液加入后72h、SKPs诱导约5～6天后可观察到脂滴出现，细胞中有小脂滴出现主要集中于细胞核周围，随着细胞诱导时间的延长小脂滴逐渐聚集成大的脂泡，细胞逐渐增大，由原来的梭形变为圆形或多角形。对照组诱导3周后，无变化，细胞内没有脂滴出现。诱导培养19天后，油红O染色，KPC组阳性细胞约为70～80％，SKP阳性细胞约为50～60％，空白对照组则见不到脂滴。　　 结论：　　 人瘢痕疙瘩前体细胞为一种类问充质干细胞样的细胞，能够表达多种MSC特定的表面标志物，不表达造血干细胞标志物。KPCs具有多向分化潜能，能够在诱导培养基条件下，分化为脂肪细胞和成骨细胞，并且这种多向分化能力较SKPs有所增强。