血管增生(neovascularization)，即从已存在的毛细血管网上大量生成新生血管的过程，是肝癌等实体性肿瘤生长和转移的关键环节。新生血管的长入不仅提供肿瘤生长需要的营养物质和氧气以及带走代谢废物，内皮细胞还为肿瘤组织生长提供促进因子如FGF-1和FGF-2等，同时新生血管形成更是癌细胞广泛浸润、转移和肿瘤复发的基础。应用血管增生抑制因子阻断肿瘤新生血管形成的饥饿疗法为克服肝癌细胞转移和减少肿瘤复发提供了新的视野，有望成为今后肝癌治疗的突破口。 在已发现的众多的血管抑制因子中，人纤溶酶原K5是目前发现的分子量小、性质稳定、活性最强的血管增生抑制剂之一。人纤溶酶原(plasminogen)含有5个环状结构域(kringles)，每个环由80个氨基酸残基组成，含3个二硫键，形成双环状构象。水解后可产生一组具有抑制血管增生作用的小分子片段：Angiostatin(kringles1-4)，kringles1-5，kringles1-3和kringles5(K5)。血管抑素(Angiostatin)用于肿瘤的治疗已进入临床Ⅰ期试验阶段。较之血管抑素(分子量约45KDa)，K5具有分子量小(16KDa)、性质稳定且活性更强(动物实验表明，Angiostatin的EI50约为70nmol/L，K5的EI50约为30nmol/L)的优点，K5还可抑制内皮细胞的迁移及诱导内皮细胞凋亡。 K5具有治疗血管增生性疾病的潜在临床应用价值和较血管抑素更多的优势，然而有关K5的实验研究还存在许多问题，主要表现在以下三点：(1)既往有关K5的实验研究主要集中在血管增生性眼病动物模型上，而有关K5在肿瘤治疗方面的研究却少有报道；(2)K5完整多肽已获美国专利和中国专利保护，无自主知识产权；(3)相对于K5功能和潜在临床应用价值的研究，其抑制血管增生的活性和Kringle结构域中二硫键的位置、数量所决定的内外环结构的关系尚不明确。 因此，本研究拟从以下三方面解决上述问题：(1)运用基因工程方法获得人纤溶酶原K5纯化蛋白，在新生血管丰富的肝癌细胞同种种植小鼠和异种种植裸鼠模型上观察K5抑制肝癌血管生成和肿瘤生长的效应并初步探讨其作用的分子机制；(2)对K5基因进行改造，获得比K5分子量更小、性质更稳定的K5突变体Ⅰ(K5mutant1，K5mut1)基因工程纯化蛋白。观察其抑制肝癌血管生成和肿瘤生长的作用及其效果；(3)根据K5蛋白的结构特征和二硫键分布特点，构建并表达K5的两个缺失突变体蛋白。在体外细胞模型和体内肝癌皮下种植瘤模型上分析其抗血管增生活性，从而判断维持K5生物活性所需的最小氨基酸序列和基本空间结构，明确K5kringle结构域和二硫键与其功能的关系。 主要研究内容和结果如下：第1部分K5缺失突变体Ⅰ、Ⅲ的构建及表达纯化1.成功构建K5缺失突变体Ⅰ、Ⅲ。通过PCR获得的目的基因片段经琼脂糖凝胶电泳分析，与预期产物大小相符(按理论计算K5为292bp，K5mutl为258bp，K5mut3为180bp)。测序结果表明目的基因片段与pET-22b(+)连接无误，阅读框架正确，K5突变体构建成功。 2.获得高纯度可溶性的突变体蛋白。鉴定正确的重组体转化到BL21(DE3)宿主菌中，经IPTG低温诱导，可表达出可溶性重组蛋白。诱导表达的细菌经溶菌酶充分消化后，离心取上清，用Ni2+-HisBindResin亲和柱纯化，获得高纯度可溶性蛋白。用凝胶成像系统(GENEGENIUS公司产品)对凝胶进行灰度扫描，结果显示纯化后重组蛋白纯度可达：K5约为92.6％，K5mut1约为96.0％，K5mut3约为90.1％。纯化的重组蛋白经Western-blot分析显有明显的免疫杂交带。 3.突变体蛋白分子量的测定。基质辅助激光解吸附飞行时间质谱法(MALDI-TOF-MS)精确测定K5、K5mut1和K5mut3的分子量分别为14.9kDa、13.7kDa和11.6kDa，与理论推算值相符。 第2部分K5抑制肝癌血管生成和肿瘤生长的作用研究1.K5特异性抑制人视网膜微血管内皮细胞(HRCEC)的生长。K5剂量依赖性地抑制HRCEC的增殖，ECs0为160nmol/L，而对人视网膜周皮细胞(HRPC)的增殖无明显影响。利用流式细胞仪检测结果可见K5处理HRCEC组的细胞凋亡率显著地高于PBS对照组(P＜0.01)，表明K5具有诱导内皮细胞凋亡的作用。K5对正常肝细胞(changliver)和肝癌细胞(HepA，Bel-7402)的增殖和凋亡无明显的作用，显示了K5具有抑制内皮细胞的高度特异性。 2.K5抑制HRCEC和肝癌细胞的迁移。K5剂量依赖性地抑制HRCEC和肝癌细胞Bel-7402、HepA的迁移，且其抗细胞的迁移作用存在细胞系的差异。K5对HRCEC及肝癌细胞Bel-7402、HepA迁移的半数有效抑制率分别是300mol/L、120nmol/L、640mol/L。 3.K5抑制肝癌小鼠肿瘤生长的效应。腹腔注射K5总剂量为7.5mg/kg时，对KM小鼠肝癌(HepA)实体瘤生长具有显著的抑制作用(P＜0.01)，抑瘤率为62％；腹腔注射K5总剂量为12.5mg/kg时，对BALB/c裸鼠肝癌(Bel-7402)实体瘤生长具有显著的抑制作用(P＜0.01)，抑瘤率为68％。 4.K5抑制肝癌血管生成的作用。采用内皮细胞特异的CD34抗体，用SP免疫组织化学法鉴定肿瘤组织的微血管密度(MVD)。结果表明：随着K5剂量的增加，肝癌组织坏死区面积扩大，未坏死区血管密度较PBS组减少(P＜0.05)，提示K5可能通过抑制血管增生来抑制肿瘤生长。 5.K5诱导肿瘤组织的凋亡。采用Westernblot分析比较HepA肝癌小鼠模型PBS组和K5治疗组肿瘤组织的Caspase3的切割变化。结果显示：PBS注射组全长Caspase3没有或很少发生切割，而K5注射组切割的条带明显增加，全长的Caspase3条带减少或消失。提示K5可以诱导肿瘤组织的凋亡。 第3部分K5抑制肝癌血管生成和肿瘤生长作用的结构基础1.K5mut1具有比K5更强的抑制内皮细胞生长的作用。增殖：K5和K5mut1抑制内皮细胞增殖的EC50分别为160nmol/L和80nmol/L；凋亡：PBS、320nM的K5、K5mut1、K5mut3处理HRCEC细胞的凋亡率分别为4.3％、23.6％、35.4％和7.4％；迁移：K5mut1具有比K5更强的抑制HRCEC细胞迁移的作用(P＜0.05)。 2.K5mut1剂量依赖性地抑制小鼠肝癌(HepA)实体瘤生长且作用较K5更强。结果显示：K5mut1总剂量为18mg/kg、9mg/kg、4.5mg/kg时，抑瘤率分别为73.6％、59.5％、28.7％。腹腔注射K5、K5mut1和K5mut3总剂量为7.5mg/kg时，抑瘤率分别为62％、75％和21％。 3.K5mut1具有比K5更强的抑制裸鼠肝癌(Bel-7402)实体瘤生长的作用。腹腔注射K5、K5mut1和K5mut3总剂量为12.5mg/kg时，抑瘤率分别为68％、77％和0％。 4.K5mut1具有比K5更强的抑制肝癌新生血管形成的作用。肿瘤组织的MVD的结果表明，K5mut1处理组的小鼠肿瘤微血管密度低于K5组。 5.K5mut3和其他两种K5的缺失突变体对HRCEC无抑制活性，对小鼠和裸鼠肝癌实体瘤的生长无明显抑制作用。 结论及研究意义1.成功构建了K5的两个缺失突变体Ⅰ、Ⅲ，并获得其基因工程纯化蛋白。 2.首次在肝癌细胞同种种植小鼠和异种种植裸鼠模型上，证实K5基因工程重组蛋白通过诱导内皮细胞和肿瘤组织凋亡、抑制新生血管阻止肝癌生长。该研究拓宽了K5治疗血管增生性疾病的范围、提高了其应用价值，也为肝癌等恶性肿瘤的治疗提供了新的强效候选药物。 3.K5缺失突变体Ⅰ具有比K5更强的抑制肝癌血管生成和肿瘤生长的作用。该研究为治疗新生血管丰富的肝癌等恶性肿瘤提供新的并拥有自主知识产权的基因工程药物，具有重大的社会和经济效益。 4.完整的Kringle结构(包含三个二硫键)是维持K5抗血管增生活性的必需结构域，而K5分子中Kringle结构域外的N端和C端氨基酸则并非其活性所必需。回答该类多肽抑制血管增生活性的结构基础。