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本课题组在过去三十年的根瘤菌资源调查与分类研究工作中,相继从不同豆科植物的根瘤中分离到一批表型性状与土壤杆菌相似的细菌。这些细菌在以前所做的数值分类试验中与土壤杆菌的参考菌株相近。为了了解这群从根瘤中分离的土壤杆菌的多样性,及其与根癌中分离的土壤杆菌的遗传差异。
本文选择了43株分离自根瘤的土壤杆菌和13株分离自根癌的土壤杆菌作为供试菌株,采用全细胞蛋白电泳、扩增16SrRNA基因限制性酶切分析(16SrDNAPCRRFLP)、扩增16S-23SrRNA基因间序列限制性酶切分析(IGSPCRRFLP)、多位点酶电泳(MLEE)、16SrRNA基因全序列测定、质粒电泳和致病基因virC扩增等技术对供试菌株做了表型和遗传型分析,同时,本文还采用根瘤菌/土壤杆菌混合接种,绿色荧光蛋白(GFP)标记以及土壤杆菌定殖宿主植物根茎调查试验,试图解释土壤杆菌与根瘤的关系。
在多样性分析中,所有分析结果均显示供试菌株归于土壤杆菌属,与以前的数值分类结果相符。16SrDNAPCRRFLP界定的群1中包含27株根瘤分离菌和5株根癌分离菌,属于根癌土壤杆菌种;群2中的3株根瘤分离菌和5株根癌分离菌是悬钩子土壤杆菌种。IGSPCRRFLP分析中,53株供试菌株得到了29种酶切图谱,而这些菌株在16SrDNAPCRRFLP分析时仅得到6种酶切带型,IGSPCRRFLP技术反映了该群根瘤土壤杆菌存在较大的遗传多样性,该技术适合于土壤杆菌种以下水平的遗传多样型研究。
对根瘤分离的土壤杆菌和根癌分离的土壤杆菌做遗传比较发现,16SrDNAPCRRFLP、IGSPCRRFLP和MLEE分析三种方法不能将两种来源的菌株分开,表明它们的遗传背景非常相似。然而,质粒电泳分析和致病基因virC扩增分析时两种来源的土壤杆菌之间存在明显差异,根瘤分离菌没有致病质粒,而根癌分离菌含有致病质粒。
回接结瘤试验结果表明所有供试菌株都不能结瘤。当土壤杆菌CCBAU81181与中华根瘤菌CCBAU10062混合回接草木樨时,CCBAU81181可以进入根瘤中,且占瘤率约为30%。GFP标记技术证实了土壤杆菌CCBAU81181存在于根瘤中。对25株土壤杆菌做了内生菌回接试验,发现有22株都可以从宿主植物的根和茎里分离到,说明土壤杆菌作为内生菌存在于豆科植物组织中是普遍现象,根瘤作为植物组织是内生菌定殖的场所之一。通过测定株高、地上部鲜重、地上部干重、瘤数、根瘤鲜重等指标分析了土壤杆菌对宿主植物生长和结瘤的影响,结果发现土壤杆菌对宿主植物的生长没有显著影响,对宿主结瘤的影响只是表现为瘤重的增加。本实验部分地解释了从根瘤中分离到土壤杆菌的原因,不同于前人的推测。