链霉菌AM-7161遗传操作系统的建立和糖基转移酶基因med-ORF8原核表达的研究

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链霉菌(Streptomyces sp AM-7161,缩写AM-7161)可以产生具有抗癌抗菌活性的芳香聚酮抗生素美达霉素(medermycin)。美达霉素生物合成中许多后期修饰步骤(比如有关脱氧六糖碳基的合成、C-糖基转移以及立体异构的形成)都是令人感兴趣的问题。但针对这个菌株的遗传操作一直非常困难,限制了对这些问题的研究,因此本研究首先对这个菌株的遗传操作系统进行了优化,然后对美达霉素生物合成中的C-糖基转移酶基因med-ORF8的原核表达系统进行了摸索。 (1)菌株AM-7161遗传操作系统的建立和优化:首先对菌株AM-7161的培养条件、原生质体制备、原生质体转化和再生的条件进行了优化;在此基础上,从大肠杆菌DH5α细胞中提取的两种质粒(整合型质粒pSET152和自主复制型质粒pWHM4*)通过原生质体转化可以高效率导入这个菌株(转化效率可达102-103转化子/微克DNA)。同时,优化了菌株AM-7161与大肠杆菌之间的接合转移系统,外源DNA也可通过接合转移系统进入AM-7161。结果表明,在这个菌株中进行遗传操作的条件已经建立,可以对一些美达霉素生物合成酶基因(如med-ORF8)展开体内功能遗传学分析(如突变分析或互补分析),同时也说明此菌株对甲基化的外源DNA不存在限制性,其染色体上含有pSET152的整合位点; (2) med-ORF8原核表达体系的建立:med-ORF8位于美达霉素生物合成基因簇中,是美达霉素合成必需的基因,推测参与了美达霉素的C-C糖苷键的形成。本研究中,首先把med-ORF8基因克隆到大肠杆菌基因表达载体pET23a(+)上,构建表达质粒pHSL51,然后把表达质粒pHSL51导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,对诱导条件了优化,并通过Western Blotting检测到目的蛋白,酶的提取和纯化条件正在进一步摸索中。 以上这些研究工作将有助于推进美达霉素生物合成基因的功能研究。
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