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增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen, PCNA)作为一种真核生物中广泛存在的蛋白质,通过其特殊的三级结构,与DNA结合并且募集相应的蛋白,参与DNA复制、DNA修复以及细胞周期等多种过程。羽衣甘蓝(Brassica oleracea var. acephala)属于十字花科芸薹属,具有较强的耐寒性和观赏性,是秋冬季节城市绿化的重要景观植物。本研究以羽衣甘蓝S13-bS13-b自交不亲和系为研究材料,分离羽衣甘蓝PCNA1和PCNA2基因全长并进行序列分析；利用Gateway技术构建带有GFP标签的表达载体,进行PCNA亚细胞定位研究；通过构建原核表达载体,原核表达纯化获得PCNA蛋白,免疫小鼠制备多克隆抗体；对羽衣甘蓝不同组织及不同发育阶段的柱头进行蛋白检测,分析PCNA蛋白表达的时空性。这些研究为PCNA的生物学功能研究奠定了基础。主要的研究结果如下：1、通过RT-PCR和RACE克隆技术从羽衣甘蓝柱头中分离得到了PCNA1和PCNA2基因。PCNA1基因全长为1127bp,其中包含5’非翻译区126bp,3’非翻译区209bp,开放阅读框792bp,对应编码一个263个氨基酸的蛋白质,预测其蛋白质分子量为29.16 kDa,等电点PI为4.61；PCNA2基因全长为1092bp,其中包含5’非翻译区87bp,3’非翻译区213bp,开放阅读框792bp,对应编码一个263个氨基酸的蛋白质,预测其蛋白质分子量为28.99 kDa,等电点PI为4.55。PCNA1和PCNA2两个氨基酸序列比对分析结果表明其序列相似性为96%,有10个氨基酸差异。2、经过信息生物学分析发现PCNA1和PCNA2存在相同的保守区域,如DNA结合位点、PCNA/WAF1-CIP1蛋白结合位点、PCNA/RFCL蛋白结合位点、PCNA/Fen-1蛋白结合为点等,属于PCNA超家族。3、根据克隆获得的PCNA1和PCNA2基因序列,利用Gateway技术分别构建PCNA1/2-PK7WGF2表达载体。使用PEG-钙离子介导拟南芥原生质体亚细胞定位法研究发现,通过Egfp融合蛋白荧光显示PCNA1和PCNA2主要表达于细胞核,说明其可能在细胞核中发挥功能,参与DNA复制及细胞周期等功能。4、通过双酶切的方法,使用Kpn Ⅰ和BamH Ⅰ两种内切酶,成功构建了pET-14b-PCNA1和pET-14b-PCNA2两种表达质粒；诱导表达PCNA1和PCNA2蛋白,通过SDS-PAGE电泳,在约35 kDa处有明显条带；通过Ni-NTA树脂,对含有His标签的PCNA1和PCNA2蛋白进行纯化,纯化得到PCNA1和PCNA2蛋白。5、以纯化的PCNA1和PCNA2蛋白为抗原,免疫小鼠,制备PCNA1和PCNA2抗体；通过ELISA对抗体效价进行检测,其中PCNA1免疫的三只小鼠中,2号小鼠效价最高；PCNA2免疫的三只小鼠中,2号小鼠效价最高。6、提取羽衣甘蓝茎、叶、花瓣、花药、柱头、花柱、子房及柱头不同发育时期植物材料蛋白质,利用PCNA1和PCNA2抗体,对PCNA1和PCNA2的表达情况进行检测。结果发现PCNA1和PCNA2蛋白在羽衣甘蓝柱头、花柱和子房中表达量较高,在花药中蛋白表达量最低；在柱头发育早期表达量最高,随着发育时期逐渐降低,在成熟柱头中表达量最低。这说明PCNA1和PCNA2可能在柱头的早期发育过程中具有重要的作用。