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目的:癌干细胞(CSCs)和上皮间质转化(EMT)细胞与胰腺癌(Pan Ca)化疗抵抗、复发和转移密切相关。有研究显示细胞代谢改变可调控癌细胞干性特征。本研究重点研究吉西他滨(GEM)耐药的Pan Ca细胞的代谢特征及其对化疗抵抗、CSCs和EMT干性的作用和潜在机制。方法:构建GEM耐药(GR)的Pan Ca细胞模型,应用荧光显微镜及其流式细胞仪检测GR及其亲代细胞(GEM敏感)(GS)细胞葡萄糖代谢改变;检测胞外乳酸含量。MTT法检测GR及GS细胞对糖酵解抑制剂2-脱氧葡萄糖(2-DG)的敏感性;并检测糖酵解相关分子(GLUT1、HKII、PKM2及LDHA)在蛋白及其m RNA水平的变化。比较GR和GS细胞在干性分子(Nanog、Sox2),CSCs表面标记分子(CD24、CD133)和体外成球能力的差异;此外,比较两者在细胞形态、EMT相关分子(E-cadherin、Vimentin、Snail1)及其侵袭、迁移能力的变化。流式细胞仪检测检测GR及GS细胞内活性氧(ROS)水平的变化,使用糖酵解抑制剂2-DG处理细胞后对GR细胞内ROS的影响,同时,观察2-DG对GR细胞的干样及EMT表型的影响。进一步利用外源性的过氧化氢(H2O2)验证ROS对GR细胞干性及其EMT表型的调节。进一步探讨Pan Ca干性分子DCLK1对GR细胞干性及EMT表型调控,及其与糖酵解和ROS的关系。最后,检测GR及GS细胞体内成瘤及转移能力,以及瘤体内DCLK1表达的变化。抑制GR细胞糖酵解后,观察其体内成瘤及转移能力的改变,进一步研究糖酵解对GR细胞干性及EMT表型的调控。结果:GR细胞对GEM的化疗抵抗显著强于GS细胞。GR较GS细胞呈现显著升高的糖酵解水平,具体表现为葡萄糖摄取量明显高于GS细胞,胞外分泌的乳酸水平亦显著提升。此外,糖酵解相关分子GLUT1、HKII、PKM2及LDHA在蛋白及m RNA水平表达显著升高(P<0.05)。不仅如此,GR较GS细胞对糖酵解依赖性增加,表现为对2-DG的IC50低于GS细胞,且2-DG可显著增强GEM的化疗敏感性。与GS细胞相比,GR细胞干性增强,表现为干性分子(Nanog和Sox2)、CSCs表面标记分子(CD24和CD133)及成球能力显著增强(三者皆P<0.05)。不仅如此,与GS细胞相比,GR细胞呈现显著的EMT表型,表现为“长梭形”细胞形态;上皮样分子E-cadherin表达下降,间质标志Vimentin和Snail1表达升高;GR呈现更强的迁移及侵袭能力。GR细胞内ROS含量较GS细胞明显减低。使用糖酵解抑制剂2-DG处理GR后,可显著升高GR胞内ROS水平,同时,2-DG可显著抑制GR细胞的干性和EMT表型,表现为Nanog、Sox2表达及成球能力降低(所有P<0.05);上皮分子E-cadherin表达升高,间质标志Vimentin和Snail1表达下降,同时,GR细胞迁移及侵袭能力降低(所有P<0.05)。当联合N-乙酰半胱氨酸(NAC)处理后,可GR细胞使受抑制的干性和EMT表型部分逆转。引入外源性的H2O2,产生类似于2-DG处理的生物学效应,表现为GR细胞干性和EMT表型特征被抑制,与NAC协同处理后,被抑制的干性和EMT表型得以逆转。与GS细胞相比,GR细胞高表达干性分子DCLK1,沉默DCLK1后,可显著抑制GR细胞的干性及EMT表型。进一步发现糖酵解通过ROS调控DCLK1表达。GS与GR细胞体内成瘤能力无明显差异,但后者瘤体高表达DCLK1,且GR细胞表现出较强的肝转移能力。抑制糖酵解后,GR细胞体内成瘤能力明显减弱,瘤体内DCLK1表达降低,且体内转移能力明显减弱。结论:GEM耐药的Pan Ca细胞糖酵解代谢显著增强,通过维持胞内较低的ROS水平,调控DCLK1表达,进而调控Pan Ca干性和EMT特性,参与化疗耐药。糖酵解-ROS-DCLK1通路可成为逆转Pan Ca化疗耐药、干性和EMT等恶性生物学行为的潜在靶点。