马传染性贫血病毒(Equine infectious anemia virus, EIAV)是一种双链RNA病毒,属于反转录病毒科(Retroviridae)慢病毒亚科(Lentivirus),是严重危害养马业的马传染性贫血(EIA)病原体。马传染性贫血病毒(EIAV)主要侵害宿主的免疫系统。马传贫病毒在急性发病期主要在组织中分化的巨噬细胞中复制,病毒可以进入存在于外周血未分化的单核细胞,但不能在单核细胞内复制形成成熟的病毒粒子。马传染性贫血病毒进入机体后,首先受到固有免疫系统的攻击,包括生理屏障和非特异性免疫细胞及其分泌的各种免疫分子。然后是特异性免疫系统的攻击,包括体液免疫和细胞免疫,由于其主要是通过细胞与细胞间的接触进行扩散,接触不到体液,所以细胞免疫在抗马传染性贫血病毒中起主要作用。主要通过CD8+T细胞接受内源性抗原刺激后分化增殖为细胞毒性T细胞发挥免疫作用。机体细胞免疫的检测对于某些疾病的诊断和发病机理研究、免疫治疗或预防接种的效果评估及环境因素对机体免疫功能的影响,都具有重要的意义。我国自主研制的EIAV弱毒疫苗是目前世界上唯一能够克服抗原变异而产生有效保护的慢病毒疫苗,也是迄今为止唯一广泛应用的慢病毒疫苗。通过对已成功的慢病毒疫苗免疫应答本质的探索,可以为HIV等其他慢病毒疫苗的研究提供借鉴。但由于相应检测方法的缺乏,限制了对于EIAV弱毒疫苗的免疫保护机制的全面认知。特别是,在近几年的研究中,本实验室利用建立的相关方法对弱毒疫苗和强度疫苗免疫诱导的免疫应答的特点的对比性分析,显示出细胞免疫应答对EIAV弱毒疫苗免疫保护中具有重要作用。因此,建立相关的免疫检测方法具有重要意义。本项研究拟建立马属动物ELISPOT的检测方法,使之能够用于EIAV感染后IFN-y表达情况的研究。同时,应用建立的方法对EIAVp26蛋白的有效表位进行初步探讨,旨在找到能够诱导免疫保护的保守性表位。为EIAV的免疫保护机制的研究以及新型疫苗的构建提供重要的科学依据。首先,从14试验马的外周血单个核细胞PBMC (Peripheral blood mononuclear cells)提取总RNA,经RT-PCR扩增后进行T-A克隆。每匹马随机挑取约10-20个阳性克隆用于序列比对及等位基因多态性的量化分析。结果显示,14匹试验马各自具有2-4个等位基因,为正在开展的针对EIAV减毒疫苗核心蛋白(p26)的CTL表位的筛选提供基础性数据。其次,建立了一种操作简单、灵敏度高、准确性好、可以对单个细胞进行检测的细胞免疫ELISPOT检测方法,可以对马传染性贫血病毒相关的细胞免疫进行检测。综上所述,本研究对所研究的14匹马进行了经典MHC-Ⅰ类分子的扩增,并对得到的序列进行了序列分析,为实验室正在进行的关于EIAV减毒疫苗核心蛋白的CTL表位的筛选提供实验支持。建立一种可以灵敏高效、简单准确、可以对单细胞进行检测的细胞免疫检测方法,为实验室以后的免疫检测提供很好的实验平台。