论文部分内容阅读
为研究日本血吸虫Wnt基因信号转导蛋白对血吸虫发育的调节作用，对不同期别和性别间Wnt的mRNA表达水平进行了分析。采用定量PCR方法比较了不同发育阶段以及单、复性感染的25天雌雄虫之间Wnt基因的mRNA的表达水平。以23天虫体cDNA为模板，分别扩增编码SjWnt1，SjWnt5和SjWnt1蛋白核苷酸序列，构建了重组表达质粒，并进行了蛋白表达及纯化。以纯化的Wnt基因重组蛋白分别免疫BALB/c小鼠制备了特异性的多抗，用于后续研究。并利用Western blot对SjWnt5蛋白在虫体不同发育阶段的表达水平进行了分析，采用免疫组化(IHC)方法检测SjWnt5蛋白在不同期别虫体的组织定位。利用Genome Walking技术分析日本血吸虫SjWnt11的基因结构。
SjWnt11mRNA在13天表达量的增加，推测SjWnt11可能调节虫体的器官发生过程。SjWnt5mRNA23天生殖器官初步建成开始，SjWnt5 mRNA在雌虫中表达逐渐下降，而在雄虫中不断上调。推测SjWnt5引发Wnt信号对虫体发育早期的器官分化有调节作用;对雌虫生殖器官的建成及性成熟雄虫的进一步发育都可能具有调节作用。SjWnt1基因的mRNA在7天时表达量最高，虫卵时期表达量次之，13天以后时期表达量维持在最低水平，推测该蛋白在卵胚发育和虫体早期器官分化过程中发挥调控作用。SjWnt4 mRNA水平在7日龄童虫的表达量最高，在其它发育阶段表达量相对较低，推测SjWnt与卵胚发育、虫体早期器官分化有关。SjWnt2同样在日本血吸虫不同发育阶段表达有差异。在虫卵时期表达量最高，7天童虫细胞分化后表达量出现下调。推测可能与卵胚形成有关。SjWnt11和frizzled7，SjWnt1、frizzled5和frizzled8，SjWnt4和frizzled9表达趋势基本一致，初步推测SjWnt11和rizzled7可能发生相互作用，SjWnt4和frizzled9可能发生相互作用，SjWnt1、frizzled5和frizzled8可能发生相互作用。在25天单性感染雌雄虫和复性感染雌雄虫中Wnt基因mRNA表达水平存在较大差异，推测Wnt信号对雌虫生殖器官的建成及性成熟雄虫的进一步发育可能具有调节作用。成功构建SjWnt11，SjWnt和SjWnt1基因原核表达质粒在大肠杆菌中成功表达，制备的多抗血清能与虫体天然蛋白的单一条带发生反应，证明多抗是有良好的特异性。通过western blot方法比较日本血吸虫SjWnt5在不同发育阶段的蛋白水平差异，SjWnt5的蛋白表达量的变化趋势与SjWnt5 mRNA变化基本一致，结合日本血吸虫发育特征，进一步证实了SjWnt基因在日本血吸虫器官分化过程起着重要作用。免疫组化(IHC)结果显示SjWnt5蛋白在虫体体壁肌细胞层有阳性着色。并获得了SjWnt11的基因结构，具有5个内含子。
对日本血吸虫SjWnt11，SjWnt1和SjWnt5进行了不同期别和性别的mRNA表达水平分析，综合分析推测Wnt通路的调节可能涉及血吸虫的多个发育条件，如细胞分化、器官形成、雌雄虫生殖器官的建成及成熟以及卵胚的发育等。为进一步利用RNA干扰等技术探讨Wnt基因对血吸虫发育的调节作用提供了基础数据。