从南海海洋真菌Paecilomyces sp.Treel-7的发酵菌体中提取分离得到的一种新的海洋化合物Tree,化学名为(3R,4S,4aS)-74-((3R,4aS)-4a-(甲酯基)-2,3,4,4a-四氢-4,8,9-三羟基-3-甲基-1-氧-1H-氧杂蒽-7-)-2,3,4,4a-四氢-4,8,9-三羟基-3-甲基-1-氧-1H-氧杂蒽-4a-羧酸,化学结构与黑麦酮酸(Secalonic acid A)近似。有关Secalonic acid A的研究仅见于Kurobane等(1987)报道的对小鼠白血病肿瘤细胞L1210具有细胞毒活性的抗肿瘤研究,而对细胞保护作用的研究未见报道。我们前期的初步研究筛选出Tree具有细胞保护作用,本论文目的主要是进一步证实海洋化合物Tree对多种神经元的保护作用及对其可能的保护机制作初步的探讨。　　 一、Tree对神经元的保护作用1.Tree对秋水仙碱诱导的大脑皮层神经元凋亡的保护作用本文通过Hoechst33258核染色、LDH相对释放量及流式细胞仪等多种凋亡检测手段初步探讨了Tree对秋水仙碱诱导的大脑皮层神经元凋亡模型的保护作用。Hoechst33258核染色结果显示Tree可浓度依赖性地降低秋水仙碱诱导的大脑皮层神经元凋亡,1,3和10μM的Tree可将神经元的凋亡率从秋水仙碱组的56.0±2.34％分别降低到51.4±1.4％,37.6±2.4％和13.3±0.4％,与秋水仙碱模型组比较3,10μM浓度的Tree组均有统计学差异(P<0.01)。而经1μM,3μM,10μM Tree预处理后LDL相对释放量从秋水仙碱模型组的166.2±7.2％分别降低为137.4±34.9％,85.3±7.0％和90.6±19.9％,与秋水仙碱模型组比较,3,10μMTree处理组均有统计学差异(P<0.01)。　　 流式细胞仪检测结果显示了1μM秋水仙碱处理大脑皮层神经元24h后细胞的存活率由正常状态时的94.8±0.15％降为73.7±0.57％,而经不同浓度Tree处理后可以提升细胞的存活率,0.1μM,1μM,3μM和10μM Tree组的存活率分别为78.7±0.64％,84.5±0.35％,90.4±0.54％和92.8±0.53％。与秋水仙碱模型组比较,1,3和10μM Tree组的细胞存活率有统计学差异(P<0.05)。　　 上述实验结果提示Tree对秋水仙碱诱导的体外培养的大脑皮层神经元凋亡具有一定的保护作用,这种保护作用在Tree的浓度为10μM时最显著。　　 2.Tree对低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡的保护作用为了深入研究Tree对神经元的保护作用,我们又在低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡模型上利用Hoechst33258核染色和LDH相对释放量检测Tree对低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡的保护作用。Hoechst33258核染色结果显示Tree在浓度为0.001,0.01,0.1μM时的神经元凋亡率分别为52.0±5.4％,35.1±3.3％和29.7±5.6％。与5mM KCl组相比,Tree在0.01和0.1μM能降低低钾引起的凋亡率升高,有统计学差异。其中0.1μM的Tree能最为明显降低神经元凋亡率,可使凋亡率从低钾组的62.0±4.3％降为29.7±5.6％,差异具有显著性(P<0.01)。LDH相对释放量的结果显示经低钾处理后的LDH相对释放量升高到167.9±21.1％,而Tree在浓度为0.001,0.01,0.1μM时的LDH相对释放量分别为154.7±15.4％,120.3±13.4％和117.5±10.4％。与5mM KCl组相比,Tree在0.01和0.1μM能降低低钾引起的LDH相对释放量的增加,差异具有显著性(P<0.01)。　　 以上的实验结果提示Tree对低钾诱导的小脑颗粒神经元的凋亡具有保护作用。这种保护作用在Tree的浓度为0.1μM时最显著。　　 3.Tree对体内外多巴胺能神经元的保护作用在1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)诱导体外原代培养的多巴胺能神经元死亡的PD细胞模型上0.01、0.1、1μM的Tree组可浓度依赖性提升MPP+降低的TH阳性神经元的数目,从MPP+组的57.34±13.6％分别提升至72.5±10.3％,86.0±2.2％,106.5±2.6％,其中0.1、1μM的Tree组与MPP+组相比有统计学差异(P<0.01)。　　 1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)能够引起小鼠中脑黑质多巴胺能神经元的丢失,纹状体内DA含量下降,我们用MPTP30mg/kg每日腹腔注射一次,连续给药五天的方法建立PD小鼠模型。利用酪氨酸羟化酶(TH)ABC染色法统计黑质内残存神经元的数目,高效液相测量纹状体多巴胺含量。结果显示:连续注射MPTP可使中脑黑质内TH阳性多巴胺能神经元减少,为对照组的52.3±3.6％:纹状体内多巴胺含量显著降低,由正常的6.62±1.33ng/mg下降到2.46±0.48ng/mg,与对照组比较均有统计学差异(P<0.01)。而0.03,0.15,0.75mg/kg的Tree预处理组能剂量依赖地提升MPTP降低的多巴胺神经元数目,从MPTP组的52.3±3.6％分别提升到70.2±3.5％,88.2±2.0％,87.3±4.6％,各组与MPTP组相比均有统计学差异(P<0.01)。其中0.15、0.75mg/kg的Tree还可显著提升纹状体多巴胺含量到3.99±0.39和4.15±0.46ng/mg,与MPTP组比较均有统计学差异(P<0.05)。　　 上述实验结果显示:MPP+能明显引起细胞死亡,Tree可拮抗MPP+的细胞毒性,显示Tree具有多巴胺能神经元保护作用。而Tree可减少由MPTP导致的多巴胺能神经元的丢失,增加纹状体内的多巴胺含量。提示Tree对PD细胞模型和动物模型中的多巴胺能神经元有很好的保护性干预作用。　　 二、Tree保护神经元机制的初步探讨1.Tree和尼莫地平能拮抗秋水仙碱诱导的大脑皮层神经元中JNK和p38的激活在秋水仙碱诱导的大脑皮层神经元凋亡模型上,利用Western blot方法检测到MAPK通路中的JNK和p38两种激酶被激活,在秋水仙碱处理6h时磷酸化水平升高至峰值。当给以不同浓度的Tree预处理后发现Tree可以浓度依赖性的降低JNK和p38的磷酸化。L-型钙离子通道拮抗剂尼莫地平同样也可浓度依赖性抑制JNK和p38的磷酸化,并能降低神经元的凋亡率。　　 上述实验结果提示Tree可以浓度依赖性的降低JNK和p38的磷酸化。尼莫地平可拮抗秋水仙碱诱导的大脑皮层神经元凋亡时JNK和p38的激活。　　 2.Tree能拮抗秋水仙碱诱导的大脑皮层神经元中caspase-3的激活秋水仙碱诱导的大脑皮层神经元凋亡时caspase-3被激活,在16h时蛋白表达水平升高至峰值。而经不同浓度的Tree预处理后发现Tree可以浓度依赖性的降低caspase-3的表达。上述结果提示Tree可能是通过拮抗caspase-3的激活从而发挥保护大脑皮层神经元作用的。　　 3.Tree具有拮抗秋水仙碱诱导的大脑皮层神经元内钙浓度升高作用激光共聚焦实验显示秋水仙碱可显著升高大鼠大脑皮层神经元胞内钙浓度[ca2+]i,6h时神经元内钙离子浓度达到最高。100μM尼莫地平能明显降低秋水仙碱诱导的钙离子浓度升高。经不同浓度Tree预处理后发现Tree可浓度依赖性减少皮层神经元内钙浓度,这种作用在10μM浓度时最显著。　　 上述实验结果提示秋水仙碱诱导的皮层神经元凋亡过程中伴随有钙离子内流,L.型钙离子拮抗剂尼莫地平可以拮抗钙离子内流。Tree对大脑皮层的保护作用很可能跟拮抗秋水仙碱诱导的大脑皮层神经元内钙浓度升高有关。提示Tree可能与尼莫地平抑制凋亡机制相似。　　 本研究的实验结果首次发现Tree具有神经元保护作用,不仅对秋水仙碱诱导的大脑皮层神经元凋亡模型和低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡模型有良好的神经元保护作用,而且对MPP+诱导的PD细胞学模型和MPTP诱导的PD小鼠动物模型也具有保护性干预作用。钙离子参与了秋水仙碱诱导的大脑皮层神经元的凋亡,应用海洋化合物Tree可抑制JNK和p38的磷酸化,也能抑制easpase-3的表达,另外Tree能拮抗大脑皮层钙离子内流。我们的实验结果提示:海洋化合物Tree可能成为新一代对神经退行性疾病具有潜在神经元保护作用的药物,并为研究和开发新一代抗神经退行性疾病药物提供了理论基础。　　 结论　　 1.Tree对秋水仙碱诱导的大脑皮层神经元凋亡、MPTP/MPP+诱导的PD动物或细胞模型黑质多巴胺能神经元死亡,以及低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡有保护性干预作用；　　 2.JNK和p38的激活是秋水仙碱诱导的大脑皮层神经元凋亡过程中所必需,而Tree很可能通过抑制JNK和p38的磷酸化从而发挥神经元保护作用的；　　 3.秋水仙碱诱导的大脑皮层神经元凋亡过程中caspase-3被激活,而Tree可能是通过拮抗caspase-3的表达来发挥神经元保护作用的；　　 4.钙离子参与了秋水仙碱诱导的大脑皮层神经元的凋亡,钙离子可能介导了JNK和p38的激活。Tree能拮抗大脑皮层神经元钙离子内流。